Abgeschnittener Ring - Beijing Solvent Co., Ltd

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 1639 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Totalsynthese von vier neuartigen Monomethoxy- und Hydroxyl-substituierten Ring-A-Dihydronarciclasin-Derivaten ermöglichte die Identifizierung des 7-Hydroxyl-Derivats als wirksames und selektives antivirales Mittel gegen SARSCoV-2 und HSV-1. Die Konzentration dieses kleinen Moleküls, das die HSV-1-Infektion um 50 % hemmte (IC50), wurde mithilfe von aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPCS) abgeleiteten Gehirnorganoiden bestimmt, die aus zwei iPCS-Linien erzeugt wurden, und wurde auf 0,504 µM und 0,209 µM geschätzt. Bei Konzentrationen bis zu 50 mM wurde keine signifikante Verringerung der Lebensfähigkeit der Organoide beobachtet. Genomische Expressionsanalysen zeigten einen signifikanten Effekt auf die angeborene Immunität der Wirtszelle und zeigten die Aktivierung der integrierten Stressreaktion über die Hochregulierung der PERK-Kinase, die Phosphorylierung des eukaryotischen Initiationsfaktors 2α (eIF2α) und Typ-I-IFN als Faktoren, die mehrere Abwehrmechanismen des Wirts gegen Viren verstärken Infektion. Nach einer Infektion der Augen von Mäusen mit HSV-1 reduzierte die Behandlung mit der Verbindung die HSV-1-Ausscheidung in vivo drastisch.

Naturstoffe spielen weiterhin eine zentrale Rolle in der Arzneimittelforschung1,2,3,4, eine Tradition, die durch die jüngsten Bemühungen zur Identifizierung neuer Leitstrukturen gegen das SARSCoV-2-assoziierte Coronavirus3 belegt wird. Bei den derzeit zugelassenen und in der Erprobung befindlichen Therapeutika handelt es sich entweder um umfunktionierte oder entwickelte Wirkstoffe, die auf wichtige virale Proteine wie die Protease- oder RNA-Polymerase-Hemmung abzielen4. Aus verschiedenen Mitgliedern der Amaryllidaceae-Pflanzenfamilie5 isolierte Alkaloide haben ein großes pharmakologisches Potenzial im Hinblick auf die krebshemmende6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, antivirale17,18,19,20,21, 22 und Acetylcholinesterase-Aktivitäten, die sie nachgewiesen haben. Über die antivirale Wirkung von Narciclasin (1) und einer Vielzahl von Alkaloiden (Abb. 1) dieser Klasse wurde vor drei Jahrzehnten berichtet17. Kürzlich wurde auch über die starke antivirale Aktivität von 1-Desoxypancratistatin (2a) und trans-Dihydrolycoricidin (2b)23 gegen DNA-Viren wie Herpes (HSV-1, VZV) und RNA-Viren einschließlich Zika (ZIKV) berichtet19,20,24. Auch das verwandte Alkaloid Lycorin (3) zeigt nachweislich eine signifikante Replikation des SARS-assoziierten Coronavirus21. Der Wirkmechanismus, der für das in der Narciclasin-Klasse beobachtete Spektrum antiviraler Aktivität verantwortlich ist, ist nicht klar. Die Hemmung der Proteinbiosynthese durch Interaktion mit dem humanen eukaryontischen Translationsverlängerungsfaktor 1A (eEF1A) wurde bereits früher in Betracht gezogen und kürzlich überprüft22. Die Breitbandaktivität nicht nur gegen DNA-, sondern auch gegen RNA-Viren ist faszinierend und könnte eher auf die Aktivierung eines Wirtsabwehrmechanismus als auf ein spezifisches virales Ziel schließen lassen. Wir stellten uns vor, dass die Entwicklung eines wirksamen und selektiven antiviralen Wirkstoffs somit als wertvolle biologische Sonde dienen würde, die notwendig ist, um die dafür verantwortlichen mechanistischen Grundlagen aufzuklären. Das Verständnis dieses Mechanismus wurde zu einer Priorität, da seine Hochregulierung eine robuste Abwehr unabhängig von schnell mutierenden viralen Proteinen bieten könnte, wie sie beispielsweise bei SARSCoV2 beobachtet wurden.

(A) Struktur natürlicher Amaryllidaceae-Bestandteile mit starker antiviraler Aktivität, Narciclasin (1), 1-Desoxypancratistatin (trans-Dihydronarciclasin) (2a), trans-Dihydrolycoricidin (2b), Lycorin (3) und das inaktive synthetische 10b-Aza-Analogon ( 4). (B) Die neuen trans-Dihydronarciclasin-Analoga 5–8 und vorgeschlagene Retrosynthese über das Cyclohexan-Derivat 9, das aus Zimtaldehyd-Derivat 10 und Azidoaceton 11 abgeleitet werden könnte.

Hier beschreiben wir die asymmetrische Synthese von vier neuen Dihydronarciclasin-Analoga mit Ring-A-monosubstituiertem C9-OMe (5), C9-OH (6), C7-OMe (7) und C7-OH (8), die das vollständig enthalten funktionalisierter Ring-C (Abb. 2). Erste Studien zur antiviralen Aktivität führten zur Identifizierung des 7-Hydroxyl-Analogs 8 allein als das strukturell minimale Analogon, das eine antivirale Aktivität gegenüber HSV-1 zeigt. Es wurde auch festgestellt, dass Verbindung 8 eine starke und selektive antivirale Aktivität gegen das SARSCoV-2-Coronavirus aufweist. Wir berichten über erste Ergebnisse zu einem biologischen Ziel und Wirkungsmechanismus von Verbindung 8, die mit der beobachteten Aktivität gegen DNA- und RNA-Viren übereinstimmen. Wir zeigen, dass Verbindung 8 die eukaryontische integrierte Stressreaktion (ISR) und das daraus resultierende Signalnetzwerk aktiviert und so Autophagie auslöst. Verbindung 8 reguliert außerdem den Sirtuin-Signalweg hoch und aktiviert so die angeborene Immunität. Die Hochregulierung dieser synergistischen antiviralen Abwehrkräfte in der Wirtszelle erklärt die beobachtete antivirale Breitbandaktivität. Wichtig ist, dass diese Prozesse nicht von Wechselwirkungen mit hochveränderlichen viralen Strukturproteinen und nichtstrukturellen Zielen wie Proteasen abhängen. Daher stellt Verbindung 8 einen wichtigen Weg zur Weiterentwicklung eines stabilen antiviralen Breitbandwirkstoffs dar. Verbindung 8 zeigte auch in einem Mausmodell eine starke In-vivo-Anti-HSV-1-Aktivität.

(A) Synthese der Ring-A-verkürzten Triacetate 16 und 17: Pd/C-Beladung und Zeit (a) 1. (CH3CH2O)2CHCH2P(CH2CH2CH3)3Br, NaH, THF; 2. 1 M HCl, RT, 95 %; (b) 11, CH2Cl2, (R)-Diphenylprolinol-TMS-Ether, Chinidin, − 10 °C – RT, 55 %; (C) H2, 15 Mol-% Pd/C MeOH, 32 h, RT, 88 %; (d) 1. DIPEA, MsCl, CH2Cl2, 10 h, RT, 2. Li(tBuO)3AlH, THF, 20 h, 0 °C – RT, 95 %; (e) 1. mCPBA, NaHCO3, CH2Cl2, 24 h, RT; 2. NaBz/H2O, 16 h, 90–95 °C; 3. Ac2O, Py, 16 h, RT, über 3 Schritte 77 %; (f) Tf2O, DMAP, CH2Cl2, 16 h, 0 °C – RT. (B) Bildung des unsymmetrischen Dimers 18: (C′) H2, 10 Mol-% Pd/C, DMDC, MeOH, 16 h, RT.

Wir haben zuvor über die Totalsynthese und antivirale Studien von 1-Desoxypancratistatin (2a) und trans-Dihydrolycoricidin (2b)23,24 berichtet. In dieser Arbeit wurde die Synthese verschiedener Modifikationen des hydroxylierten Ring-C und ihre antiviralen Aktivitäten untersucht. So erwiesen sich beispielsweise das C3-Epimer von 2b25 und anderen Analoga sowie das vollständig funktionalisierte Aza-Analogon 426 als völlig frei von antiviraler Aktivität. Bisher scheint Verbindung 2b die Minimalstruktur zu sein, die eine starke antivirale Aktivität aufweist, eine Aktivität, die durch die Hinzufügung der in Verbindung 2a17 vorhandenen C7-Hydroxylgruppe deutlich verstärkt wird. Weitere Modifikationen am Ring-C als Mittel zur Optimierung der antiviralen Wirksamkeit und Selektivität scheinen weiterhin erfolglos zu sein. Diese Ergebnisse richteten unseren Fokus auf die Ring-A-Substituenten als letztes verbleibendes Fragment, das zur Modifikation verfügbar war. Alle auf RNA-Virusaktivität untersuchten Analoga besitzen den 8,9-Methylendioxy-Substituenten, der an Ring-A22 kondensiert ist. Nur eine frühere Studie hat alternative Ring-A-Hydroxylpositionierungen untersucht. Alonso und Mitarbeiter berichteten über die Synthese des 8-Hydroxyl-Analogs, bei dem festgestellt wurde, dass es eine deutlich verringerte Antikrebsaktivität aufweist, obwohl seine antivirale Aktivität nicht untersucht wurde27. Um den Beitrag eines einzelnen Hydroxyl- oder Methoxygruppensubstituenten in Ring-A zur antiviralen Aktivität abzugrenzen, haben wir unsere ursprüngliche Synthese von 1-Desoxypancratistatin (2a) und trans-Dihydrolycoricidin (2b) ausgehend von Metaanisaldehyd (12) modifiziert. .

Die Synthese der Zielverbindungen 5–8 wurde durch eine konvergent-divergente Strategie über das gemeinsame Zwischenprodukt 15 (Abb. 2A) mit erheblichen Modifikationen unseres veröffentlichten Syntheseprotokolls23 erreicht. Kommerziell erhältlicher 3-Methoxybenzaldehyd 12 wurde einer Homologation von Aldehyd zu Alkenal mit zwei Kohlenstoffatomen unter Verwendung eines Diethylacetal-funktionalisierten Wittig-Reagens unterzogen, was den 3-Methoxyzimtaldehyd 10 in einer Ausbeute von 95 % ergab. Die durch Iminiumionen vermittelte asymmetrische organokatalytische schrittweise [3 + 3]-Michael-Aldol-Sequenz von 10 mit Azidoaceton 11 verlief unter Verwendung der (R)-Diphenylprolinol-trimethylsilylether- und Chinidin-Katalysatoren reibungslos und lieferte das Cycloaddukt 9 in 55 % isolierter Ausbeute. Die Hydrierung der Azido-Funktionsgruppe von 9 mit 10 % Pd/C in Gegenwart von Dimethyldicarbonat ergab das gewünschte Methoxycarbonyl-geschützte Cyclohexanon 13 sowie ein kleineres Nebenprodukt, das sich als strukturell interessantes monoaromatisiertes Dimer 18 erwies (Abb. 2B). Um die Selektivität zugunsten von 13 zu verbessern, ermöglichten Verdünnung (0,1 M) und längere Reaktionszeit die Isolierung des Methoxycarbonyl-geschützten Cyclohexanons 13 in 75 % isolierter Ausbeute zusammen mit dem Nebenprodukt 18 in 10 % isolierter Ausbeute. Interessanterweise führte eine Erhöhung der Katalysatorbeladung um bis zu 15 % unter sonst gleichen Reaktionsbedingungen nur zur gewünschten Verbindung 13. Dieses geringfügige Nebenprodukt weist darauf hin, dass die erwartete Reduktion des Azids 9 erfolgreich war, das freie Aminoketon erfährt dann eine Umwandlung. situ-Dimerisierung, gefolgt von Dehydratisierung und Aromatisierung eines Rings (möglicherweise über ein Enamin-Zwischenprodukt), wodurch 18 entsteht. Das Carbamat 13 und sein Enantiomer ent-13, identisch hergestellt unter Verwendung von (S)-Diphenylprolinol-trimethylsilylether, wurden beide zu > 99 % gefunden bzw. > 98 % Enantiomerenüberschuss (ee) (Basislinie aufgelöst) mittels chiraler HPLC (AD-H-Säule). Die Dehydratisierung von 13 über das in situ gebildete Mesylat und die sofortige Reduktion des Ketons mit dem sperrigen Lithium-tri-tert-butoxyaluminiumhydrid ergaben in beiden Schritten ausschließlich den äquatorialen Alkohol 14 in einer Ausbeute von 95 %. Durch die Epoxidierung des Allylalkohols 14 entstehen beide diastereomeren Epoxide, die stereospezifisch durch ausschließlichen axialen Angriff mit Natriumbenzoat in Wasser geöffnet werden, wodurch das 2,3-diaxiale 4-äquatoriale Triol entsteht, das mit Ac2O in Gegenwart von Pyridin zum Triacetat 15 acetyliert wird in 77 % Gesamtausbeute aus 13. Der Phenanthridonring wurde mithilfe der Banwell-Modifikation der Bischler-Napieralski-Reaktion28 geschlossen, was die regioisomeren tricyclischen Produkte 16 und 17 ergab. Die Verbindungen 16 und 17 wurden klar auf Kieselgel gelöst und durch Gradientenelutions-Flashchromatographie ausgehend von abgetrennt 100 % Dichlormethan, ergibt 16 (Hauptbestandteil) und 17 (Nebenbestandteil) in 51 % bzw. 15 % isolierter Ausbeute. Die selektive Abspaltung des C9-Methylethers in 16 erwies sich als problematisch. Versuche zur Spaltung mit Standardreagenzien wie TMSI oder BBr3 ergaben Produktgemische, und die Verwendung von BCl3-Dimethylsulfid führte zur Esterspaltung. Dennoch wurde festgestellt, dass die Verwendung von AlCl3 in Gegenwart des Phasentransferkatalysators Tetrabutylammoniumiodid (1:3) nach einem von Steglich und Mitarbeitern29 entwickelten Protokoll erfolgreich war. Dieses Verfahren lieferte die Phenolverbindung 19 in einer Ausbeute von 88 %. Die gleichen Reaktionsbedingungen wurden für die Spaltung des C7-Methylethers 17 wiederholt, was ebenfalls das demethylierte Phenol 20 in 89 % Ausbeute lieferte. Eine umfassende Verseifung der Acetatgruppen konnte in den Verbindungen 16, 19, 17 und 20 unter Verwendung von K2CO3 und wässrigem Methanol problemlos erreicht werden, was schließlich die erforderlichen Verbindungen 5, 6, 7 bzw. 8 ergab (Abb. 3).

Synthese von Ring-A-verkürzten trans-Dihydronarciclasin-Derivaten (5–8). (a) K2CO3, MeOH, 95 %; (b) AlCl3/TBAI, CH2Cl2:C6H6 (1:1) 88 %; (C) K2CO3, MeOH, 94 %; (d) K2CO3, MeOH, 96 %; (e) AlCl3/TBAI, CH2Cl2:C6H6 (1:1) 89 %; (f) K2CO3, MeOH, 96 %.

Wir haben kürzlich gezeigt, dass trans-Dihydrolycoricidin (2b) die HSV-1-Replikation wirksamer hemmt als Aciclovir (ACV) und die Reaktivierung von HSV-1 durch Latenz in einem Ex-vivo-Mausmodell verhindert20,25. Außerdem wurde gezeigt, dass 2b eine mäßige Wirksamkeit gegen HSV-1-Stämme aufweist, von denen berichtet wurde, dass sie gegen ACV resistent sind, wie etwa den tk-Stamm von HSV-1, dem die Thymidinkinase-Aktivität fehlt30, und den PAAv-Stamm, der virale Mutationen entwickelt hat DNA-Polymerase nach Inkubation mit Phosphonoessigsäure31. Die antivirale Aktivität von 2b gegen andere DNA-Viren (HSV-1, HCMV, HBV) und RNA-Viren (HCV, ZIKV-Stämme FSS-13025 und PE-243) wurde ebenfalls nachgewiesen20. Eine etwas höhere Toxizität wurde für 2b im Vergleich zu Aciclovir in Fibroblasten und Hepatozyten beobachtet, während eine geringere Toxizität in iPSC-abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen (NPCs) festgestellt wurde.

Die antivirale Aktivität der neuen Monohydroxyl- und Methoxyderivate 5, 6, 7 und 8 wurde zunächst in zwei neuralen Vorläuferzelllinien (NPC) getestet und mit Aciclovir, dem „Goldstandard“ zur Behandlung von HSV-Infektionen, verglichen. NPCs wurden in diesem ersten Bildschirm aus zwei Gründen verwendet; (i) die Notwendigkeit, eine Plattform aus ZNS-Zellen einzusetzen, und (ii) die höhere Anfälligkeit von NPCs für HSV-1 im Vergleich zu Neuronen. Menschliche NPCs wurden wie zuvor beschrieben von iPSCs abgeleitet32. NPCs wurden mit einem HSV-1-Konstrukt (DualF) infiziert, das verstärktes grün fluoreszierendes Protein (EGFP) und monomeres rot fluoreszierendes Protein (RFP) unter der Kontrolle der viralen Promotoren ICP0 bzw. Glykoprotein C32 mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) exprimierte. von 0,1, wie im experimentellen Abschnitt B beschrieben. Die Expression der fluoreszierenden Reportergene EGFP und RFP wurde als Proxys der viralen Genexpression angesehen. Zwei Stunden nach der Infektion wurden die Inokula entfernt und die Zellen in Gegenwart der oben beschriebenen Monomethoxy/Hydroxy-Analoga in einer Konzentration von 10 μM oder ACV in einer Konzentration von 50 μM kultiviert und am Tag 3 nach der Infektion (pi) getestet. Die Analyse der Durchflusszytometrie (FC) ergab, dass Verbindung 8 den Prozentsatz der EGFP+-RFP+-Zellen um das 6,76- bzw. 4,65-fache und in 01SD- bzw. 9001-NPCs im Vergleich zu infizierten Zellen, die dem Vehikel ausgesetzt waren, reduzierte (Abb. 4A). Verbindung 2b führte zur größten Reduktion fluoreszierender Zellen (01SD: (8016-fach; 9001: 424-fach). Überraschenderweise zeigten die Analoga 5, 6 oder 7 keine Anti-HSV-1-Aktivität (Abb. 4A). Verbindung 5 erwies sich auch als unvollständig löslich in DMSO und wurde daher nicht weiter berücksichtigt. Bei Konzentrationen bis zu 50 μM war die Zelllebensfähigkeit von mit ACV und mit Verbindung 8 behandelten Kulturen vergleichbar (Abb. 4B). Umgekehrt wurde bei 2b eine Verringerung der Zelllebensfähigkeit beobachtet -behandelte Kulturen ab 25 μM in Übereinstimmung mit der zuvor für 2b diskutierten Zytotoxizität. Auch hier zeigten die Verbindungen 6 und 7 keine Anti-HSV-1-Aktivität. Daher basiert die Quantifizierung der Virusinfektion und der Zelllebensfähigkeit auf einer Struktur-Aktivitäts-Beziehungsanalyse Unter Verwendung von einschichtigen 2D-NPC-Kulturen wurde Verbindung 8 als neuartiges Anti-HSV-1-Medikament mit einer mit ACV vergleichbaren oder sogar besseren Wirksamkeit identifiziert. Die antivirale Wirksamkeit von 2b und 8 sowie die von 8 allein nachgewiesene Selektivität offenbaren ein privilegiertes Pharmakophor in Verbindung 8, einzigartig in der weiteren Verfeinerung der beobachteten selektiven antiviralen Aktivität.

Die Verbindungen 2b und 8 hemmen HSV-1 in humanen iPSC-abgeleiteten NPCs in unterschiedlichem Ausmaß. (A) Durchflusszytometrie (FC)-Analyse der nicht infizierten und infizierten NPC-Linien 01SD und 9001 in Gegenwart oder Abwesenheit von ACV, 2b und seinen Derivaten 6, 7 und 8 unter Verwendung eines manipulierten HSV-1-Konstrukts DualF, das EGFP aus einem IE-Gen exprimiert Promotor und RFP von einem späten Genpromotor. NPCs wurden mit einer Infektionsmultiplizität von 0,1 infiziert. Die oben genannten Verbindungen wurden zwei Stunden pi hinzugefügt und die Kulturen wurden am Tag 3 pi analysiert. Die Fraktionen der Zellen, die Fluoreszenz der entsprechenden Farbe zeigen, sind angegeben. (B) Die Zytotoxizität von 2b, 8 und ACV in unterschiedlichen Konzentrationen in nicht infizierten 01SD-NPC-Kulturen wurde von FC unter Verwendung von fixierbarem Lebensfähigkeitsfarbstoff bewertet. Die Daten repräsentieren einen Durchschnitt von sechs unabhängigen Experimenten. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar. Eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von einem Bonferroni-Post-hoc-Test wurde verwendet, um die Reduktion von EGFP-RFP+-Zellen nach Behandlung infizierter Zellen mit getesteten Verbindungen im Vergleich zu HSV-1 + Vehikel zu vergleichen: *P = 0,0124; **P < 0,0001.

Obwohl die klassischen 2D-Monoschichtkulturen Arzneimittelscreening-Prozesse erleichtern, rekapitulieren sie nicht die 3D-Architektur und die physiologische Mikroumgebung eines lebenden Gewebes. Bedingungen. Infolgedessen spiegeln Arzneimittelwirkungen in einer 2D-Mikroumgebung die Arzneimittelwirkungen in vivo möglicherweise nicht genau wider. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass dreidimensionale Kulturen die Vorhersagbarkeit der Arzneimittelaktivität in vivo erhöhen33. Daher wurde die inhibitorische Aktivität von 2b und seinen Derivaten gegen HSV-1 in einer 3D-Kulturplattform bestehend aus Gehirnorganoiden untersucht. Eine Charakterisierung differenzierender Organoide ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Vierzehn Wochen alte Gehirnorganoide, die aus 9001- und 01SD-iPSCs erzeugt wurden, wurden einzeln 2 Stunden lang mit dem HSV-1-DualF-Virus (6000 pfu/Organoid) infiziert. Nach der Infektion wurden die Organoide in Gegenwart oder Abwesenheit der getesteten Verbindungen (10 μM) oder ACV (50 μM) kultiviert. Am Tag 3 pi wurde in mit 2b und 8 behandelten infizierten 9001- und 01SD-Organoiden keine Expression von EGFP- und RFP-Reportergenen beobachtet. Wie erwartet hemmte ACV auch wirksam die HSV-1-Infektion (Abb. 5). Im Gegensatz dazu zeigten die Derivate 6 und 7 keine Anti-HSV-1-Aktivität (Abb. 5). Diese Ergebnisse bestätigen die Fähigkeit des neuen Analogons 8 allein, eine HSV-1-Infektion zu hemmen.

Die Anti-HSV-1-Wirksamkeit von Verbindung 8 ist in menschlichen Gehirnorganoiden mit der von 2b und ACV vergleichbar. Vierzehn Wochen alte Gehirnorganoide, die aus den iPSC-Linien 9001 und 01SD erzeugt wurden, wurden einzeln mit dem HSV-1-DualF-Konstrukt (6000 pfu/Organoid) infiziert. Zwei Stunden nach der Infektion wurden die Inokula entfernt, die Organoide gewaschen und in Gegenwart der getesteten Verbindungen kultiviert. Die Expression der fluoreszierenden Gene EGFP und RFP wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop am Tag 3 pi N = 3 für jede Bedingung visuell untersucht. Maßstabsbalken: 50 μm.

Als nächstes wurde die Konzentration von 8 bestimmt, die die HSV-1-Infektion um 50 % (IC50) in 9001- und 01SD-Organoiden hemmte. Sechzehn Wochen alte Gehirnorganoide wurden wie oben beschrieben infiziert und nach 2 Stunden einer steigenden 8-Konzentration im Bereich von 0,01 bis 50 μM ausgesetzt. Am Tag 3 pi wurde der IC50 von 8 durch Messung der Intensität des fluoreszierenden Reportergens EGFP (dessen Expression unter der Kontrolle des Promotors des unmittelbar frühen HSV-1-Gens ICP0 steht) in den infizierten Organoiden untersucht. Die EGFP-Expression wurde als Proxy für die virale Genexpression in frühen Stadien einer akuten HSV-1-Infektion verwendet. Der IC50 von Verbindung 8 wurde bei 9001 mit 0,504 µM und bei 01SD-Organoiden mit 0,209 µM bestimmt (Abb. 6A). Bei Konzentrationen bis zu 50 μM wurde keine signifikante Verringerung der Lebensfähigkeit von Organoiden beobachtet, die durch die Verwendung von Calcein AM bestimmt wurde, was auf einen großen Sicherheitsspielraum in diesem Assay hinweist (Abb. 6B).

Antivirale Wirksamkeit und Zytotoxizität von 8 gegen HSV-1 in Organoiden des menschlichen Gehirns. (A) Sechzehn Wochen alte 9001- und 01SD-Gehirnorganoide wurden einzeln mit dem HSV-1-DualF-Konstrukt (6000 pfu/Organoid) infiziert. Nach 2 Stunden wurden die Inokula entfernt und 8 (799) in unterschiedlichen Konzentrationen (100 nM–50 μM) zugegeben. Der IC50 wurde durch Bestimmung der korrigierten Gesamtzellfluoreszenz (CTCF) geschätzt, die durch Messung der EGFP-Fluoreszenz in Organoiden mit ImageJ und Normalisierung für den Hintergrund mithilfe der Gleichung CTCF = integrierte Dichte − (Fläche des Organoids × mittlere Fluoreszenz der Hintergrundwerte) erhalten wurde. (B) Die Zytotoxizität von 8 ohne HSV-1-Infektion wurde mit Calcein-AM bewertet. Die Fluoreszenz von Calcein-AM in jedem Organoid wurde gemessen und der CTCF wurde wie oben beschrieben bestimmt. Die Daten repräsentieren einen Durchschnitt von sechs unabhängigen Experimenten. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar. Eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von einem Post-hoc-Test unter Verwendung der Tukey-Mehrfachvergleichskorrektur, wurde verwendet, um die Lebensfähigkeit der Zellen bei verschiedenen Arzneimittelkonzentrationen zu vergleichen. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Lebensfähigkeit der Zellen zwischen den Bedingungen festgestellt. Maßstabsbalken: 50 μm.

Die antivirale Aktivität der Verbindungen 2b und 8 gegen das COVID-19-assoziierte Coronavirus SARS-CoV2 in Calu3-Zellen (ATCC, HTB-55) wurde unabhängig an den National Institutes of Health (NIH) bewertet. Für Verbindung 2b wurde ein IC50-Wert von 0,18 µM und ein CC50-Wert von 3,48 µM ermittelt, was eine therapeutische Selektivität von 19 ergibt. Das neue Analogon 8 erwies sich mit einem IC50-Wert von 0,09 µM und einem CC50-Wert von 1,92 µM als sowohl wirksamer als auch etwas besserer Selektivität , was einer therapeutischen Selektivität von 20 entspricht. Die positive Kontrolle Remdesivir zeigte in diesem Test einen IC50-Wert von 0,06 µM (ergänzende Abbildung 3).

Angesichts der beobachteten Aktivität sowohl bei DNA- als auch bei RNA-Viren führten wir eine RNA-Sequenzierungsanalyse an Wirtszellen durch, die mit den synthetischen Alkaloiden behandelt wurden, um Veränderungen in den Transkriptionsniveaus zu bewerten und so die Wirkwege aufzuklären. Nicht infizierte 02SF-NPCs-Zellen wurden 72 Stunden lang mit 2b, 8, 6 (802) oder 7 (718) (10 μM) inkubiert. Nach der Extraktion wurden die Wirts-RNA-Sequenzen analysiert. Insgesamt wurden 12.433 menschliche Gene bei TPM ≥ 5 in mindestens einem Replikat unbehandelter NPCs exprimiert. Wenn NPCs mit den Verbindungen 2b, 8, 6 oder 7 inkubiert wurden, war die Expression von 7766 (62,5 %), 7433 (59,8 %), 256 (2,1 %) bzw. 33 (0,3 %) Wirtszellgenen signifikant verändert (FDR-korrigierter p ≤ 0,05, maximaler Gruppenmittelausdruck TPM ≥ 5). Mittels quantitativer RT-PCR bestätigten wir Veränderungen der mRNA-Spiegel für vier ausgewählte Gene, die durch die Verbindungen 2b und 8 in den RNA-Sequenzierungsanalysen signifikant verändert wurden (ergänzende Abbildung 2).

Die Ingenuity Pathway Analysis (IPA) identifizierte kanonische Pfade, die sich signifikant veränderten, wenn hiPSC-NPCs mit 2b und 8 inkubiert wurden. Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung rechtsseitiger Fisher Exact Probability Tests berechnet; Biologische Pfade mit einem p-Wert < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Die zehn am signifikantesten veränderten Signalwege sind in Abb. 7 dargestellt. Der Signalweg des eukaryontischen Initiationsfaktors 2 (EIF2) war am signifikantesten verändert (2b: z-Score: − 2,857, p-Wert = 5,09E−39; 8: z-Score: − 1,763, p-Wert = 2,43E−30). IPA-Analysen deuteten auch auf eine Netto-Hochregulierung der Autophagie- und Sirtuin-Signalwege hin.

Menschliche Genpfade wurden durch 2b und 8 signifikant verändert. Differentiell exprimierte Gene (DEG), gemessen durch den Vergleich von mit 2b und 8 behandelten NPCs mit mit Vehikel behandelten NPCs, wurden einer Ingenuity Pathway Analysis (IPA) unterzogen. Die 10 wichtigsten Pfade mit der größten statistischen Signifikanz (p-Wert des Fisher's Exact Test) werden angezeigt. Die Aktivierung (+ve z-Score, orangefarbene Balken) oder Hemmung (−ve z-Score, blaue Balken) jedes Signalwegs ist ein Maß für experimentell bestimmte Genexpressionsänderungen, über die in der Literatur berichtet wird. Die Intensität der Farbe gibt den Grad der Aktivierung/Hemmung an. Pfade ohne Aktivitätsmuster sind grau. Die Verhältnisse (orangefarbenes Quadrat über jedem Pfad) stellen den Grad der Überlappung zwischen DEG und allen Mitgliedern eines bestimmten Pfads dar. Die Y-Achse rechts zeigt die Verhältniswerte an.

Diese Ergebnisse legten sofort die Hypothese nahe, dass die Verbindungen 2b und 8 die Virusreplikation beeinflussen könnten, indem sie die integrierte Stressreaktion (ISR) auslösen, die wiederum die 5'-Methylkappen-abhängige mRNA-Translation blockieren könnte34,35. Um diese Hypothese zu testen, untersuchten wir die Phosphorylierung der α-Untereinheit des eukaryontischen Initiationsfaktors 2 (eIF2α ~ P) an Serin 51 in NPC-Kulturen, die den Verbindungen 2b und 8 ausgesetzt waren, und verglichen sie mit unbehandelten NPCs oder NPCs, die mit dem Derivat 7 behandelt wurden weist keine antivirale Aktivität auf. Tatsächlich zeigte die immunzytochemische Analyse eine erhöhte eIF2α ~ P-Immunreaktivität in den mit 2b und 8 behandelten Kulturen (Abb. 8). Diese Ergebnisse bestätigen, dass die Phosphorylierung von e1F2α hochreguliert ist und dass die Aktivierung der integrierten Stressreaktion (ISR) einer der Hauptmechanismen ist, die der antiviralen Aktivität dieser kleinen Moleküle zugrunde liegen. Die RNAseq-Analyse zeigte auch, dass die Phosphorylierung der α-Untereinheit des eukaryotischen Initiationsfaktors 2 durch die eIF2α-Kinase EIF2KA3 (PKR-ER oder PERK) in den mit 2b und 8 behandelten Kulturen vermittelt wird (Abb. 8). Die RNA-Sequenzierungsdaten stimmen somit vollständig mit der Hypothese überein, dass 2b und 8 durch die Aktivierung eines ISR eine antivirale Reaktion des Wirts auslösen.

Aktivierung der integrierten Stressreaktion in 2b- und 8-behandelten NPCs. (A) Von 9001 iPSC-Linien abgeleitete NPCs wurden den Verbindungen 7, 8 und 2b (10 μM) ausgesetzt. Nach 24 Stunden wurden die Zellen fixiert und mit einem Antikörper angefärbt, der an Serin 51 phosphoryliertes eIF2α (EIF2S1) erkennt. Die Kerne wurden mit Hoechst 33342 gegengefärbt und die Phosphorylierung wurde durch Fluoreszenzmikroskopie beurteilt. (B) Die korrigierte Gesamtzellfluoreszenz (CTCF) wurde durch Messung der EIF2S1-Fluoreszenz in Zellen, in denen ein Fluoreszenzsignal nachgewiesen werden konnte, und Normalisierung für die Zellfläche unter Verwendung der Gleichung CTCF = integrierte Dichte − (Zellfläche × mittlere Fluoreszenz der Hintergrundwerte) erhalten. Fehlerbalken sind Standardabweichungen. Eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von einem Bonferroni-Post-hoc-Test wurde verwendet, um CTCF zwischen den verschiedenen Bedingungen zu vergleichen: ** (P = 0,0042); **** (P < 0,0001). (C,D) Hochregulierung der EIF2A-Kinase EIF2AK3 (C) und des aktivierten Transkriptionsfaktors 4 (ATF4) (D) in 2b- und 8-behandelten NPCs. Faltungsänderungen wurden aus den im Abschnitt „Methoden“ beschriebenen RNA-seq-Daten berechnet. (E) Vorgeschlagener Wirkmechanismus von 2b und 8.

ISR wirkt auf der Ebene der Translationsinitiierung, um die globale Proteinsynthese zu unterdrücken (und gleichzeitig die Translation mehrerer Proteine zu verbessern, die an der Zellerholung beteiligt sind). Die ISR-induzierte Herunterregulierung der Virusproteinsynthese ist ein wirksamer antiviraler Abwehrmechanismus. Darüber hinaus führt die eIF2-Phosphorylierung zu einer erhöhten Synthese des aktivierenden Transkriptionsfaktors 4 (ATF4), der dann zum Zellkern transportiert wird, um Gene zu transaktivieren, die die Zelle zur Anpassung an Stress wie Autophagie benötigt36. In HSV-1-infizierten Zellen. Autophagie-Proteine zielen auf virale Komponenten oder Virionen für den lysosomalen Abbau ab37. Darüber hinaus verstärkt die Aktivierung des Sirtuin-Signalwegs die antiviralen Eigenschaften. Interessanterweise wurde gezeigt, dass SIRT1, eine NAD-abhängige Deacylase/Mono-ADP-Ribosyltransferase, die das Wachstum von DNA- und RNA-Viren hemmen kann, hochreguliert ist (ergänzende Abbildung 2). Die Hochregulierung von SIRT1 könnte auch zur antiviralen Breitbandaktivität beitragen, die bei den Verbindungen 2b und 838,39 beobachtet wird.

Die antivirale Wirksamkeit von Verbindung 8 wurde in einem In-vivo-Mausmodell weiter untersucht und bestätigt. ND4-Swiss-Mäuse wurden nach einer leichten Hornhautskarifizierung, wie im Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschrieben, in den Augen mit HSV-1 infiziert. Zur gleichen Zeit, als das Virus angewendet wurde, wurde eine Gruppe von Mäusen (n = 10) mit einer 50 uM Lösung der Verbindung 8 in DMSO behandelt und die andere Gruppe (n = 10) wurde mit DMSO (Vehikel) behandelt. Die Augen wurden 4 Tage lang jeden Tag entweder mit Vehikel oder Verbindung 8 behandelt. Die Augen wurden täglich abgewischt und die Ausscheidung infektiöser Viren wurde mittels Standard-Plaque-Assay beurteilt. Wie in Abb. 9 gezeigt, reduzierten die mit Verbindung 8 behandelten Augen die Ausbeute an infektiösem Virus in den Tränen im Vergleich zu mit Vehikel behandelten Augen drastisch. Der Titer des infektiösen Virus in den mit Vehikel behandelten Augen erreichte seinen Höhepunkt am Tag 2 nach der Infektion, wohingegen sich der Höhepunkt in der 8. Behandlungsgruppe um einen Tag verzögerte und fast um das Dreifache reduziert wurde.

Antivirale Aktivität in vivo. ND4-Swiss-Mäuse wurden durch Hornhautskarifizierung mit 1 × 105 pfu HSV-1-Stamm 17syn+ infiziert. Die Augen wurden 4 Tage lang täglich abgewischt und mittels Standard-Plaque-Assay auf infektiöse Viren untersucht. Verbindung 8 (Code R799) reduziert die HSV-1-Ausscheidung im Mausauge drastisch.

Zusammenfassend berichten wir über die Entwicklung und antivirale Aktivität eines neuartigen verkürzten Ring-A-synthetischen Alkaloids 8 gegen HSV-1 und SARSCoV2. Mechanistische Untersuchungen zeigen eine Aktivierung der Wirtsabwehr durch Hochregulierung des integrierten Stressreaktionswegs, was zu Autophagie führt. Diese Arbeit demonstriert die Anwendung eines niedermolekularen antiviralen Wirkstoffs zur Induktion der angeborenen Immunität durch Aktivierung der EIF2-Kinase (EIF2AK3 oder PERK) als Mechanismus zur Hochregulierung des ISR. Die Hochregulierung der Abwehrmaschinerie der Wirtszelle nach einer Virusinfektion mit einem therapeutischen Prototyp wie 8 offenbart ein attraktives Paradigma für die Entwicklung eines antiviralen Breitbandwirkstoffs mit einer vorhergesagten geringeren Neigung zur Resistenz gegen antivirale Arzneimittel. Die Fähigkeit, die angeborene antivirale Immunität durch Interferonstimulation vom Typ I und/oder III zu aktivieren, wurde für niedermolekulare Lipide wie Gallensäuren40, Retinoide41 und das topische antivirale Mittel Imiquimod42 beschrieben, wobei komplexe Regulationswege beteiligt sind. Vor dieser Arbeit war der Beitrag der Ring-A-Oxysubstituenten von Alkaloiden vom Narciclasin-Typ zur antiviralen Aktivität unbekannt22. Während die Fähigkeit dieser Alkaloidklasse, die Proteinbiosynthese auf ribosomaler Ebene zu hemmen, bekannt war, waren das Ziel und der Mechanismus nicht klar22. Frühere Studien deuteten auf eine Hemmung der Proteinbiosynthese der Wirtszelle durch den Translationsverlängerungsfaktor 1A hin. Es wurde gezeigt, dass das komplexe, aus dem Meeresascidian stammende Depsipeptid Plitidepsin über die Hemmung des Elongationsfaktors eEF1A43 eine Anti-SARSCoV2-Aktivität aufweist. Die vorliegende Arbeit weist darauf hin, dass die verkürzten Alkaloide vom Narciclasin-Typ auch deutlich vorgeschaltet wirken und dass die Hemmung der Translation teilweise ein Folgeereignis ist, das durch P-eIF2-alpha vermittelt wird. Das RNA-Sequenzierungsprofil liefert eine molekulare Signatur, die die Entwicklung eines selektiven antiviralen Wirkstoffs ermöglicht, da eine längere und übermäßige Aktivierung des ISR zum programmierten Zelltod führen kann. Diese Arbeit identifiziert die hochregulierte Phosphorylierung von Wirts-eIF2α als präzises Ziel, das mit der bekannten biologischen Aktivität dieser Alkaloide übereinstimmt. Eine modulierte Aktivierung des ISR kann dann zu einer verminderten Proteinexpression und Autophagie führen, was auf selektive Weise zu einer starken antiviralen Aktivität führt.

Chemikalien und Lösungsmittel wurden von Acros, Aldrich, JT Baker, Caldeon, Solvay und Fluka gekauft und wie erhalten verwendet, mit den unten aufgeführten Ausnahmen. Deuterierte Lösungsmittel wurden von ACP Chemicals, Toronto, Kanada, bezogen. Tetrahydrofuran (THF), Diethylether (Et2O) und Toluol wurden aus Natrium/Benzophenon unter einer Atmosphäre aus trockenem Stickstoff destilliert; Dichlormethan (CH2Cl2) wurde aus Calciumhydrid unter einer Atmosphäre aus trockenem Stickstoff destilliert; Methanol (MeOH) wurde aus Magnesiumspänen unter einer Atmosphäre aus trockenem Stickstoff destilliert; Triethylamin (NEt3), N,N-Diisopropylethylamin (Hünig-Base) und Pyridin wurden aus Kaliumhydroxid unter einer Atmosphäre aus trockenem Stickstoff destilliert; Festes Natriumhydrid (NaH) wurde durch Filtration und Waschen mit n-Hexanen erhalten.

Alle nichtwässrigen Reaktionen wurden in flammengetrockneten Rundkolben oder in nicht flammengetrockneten bernsteinfarbenen 1,5-Dram-Fläschchen durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Reaktionen magnetisch gerührt und durch Dünnschichtchromatographie (TLC) überwacht. Die DC wurde auf Macherey-Nagel-Silicagel 60 F254 DC-Aluminiumplatten durchgeführt und mit UV-Fluoreszenzlöschung und Kaliumpermanganat (KMnO4) oder 2,4-Dinitrophenylhydrazin oder p-Anisaldehyd-Färbungen sichtbar gemacht1. Konzentrationen unter reduziertem Druck wurden durch Rotationsverdampfung bei 40 °C und dem entsprechenden Druck durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Die säulenchromatographische Reinigung wurde als Flash-Säulenchromatographie mit einem Druck von 0,3–0,5 bar unter Verwendung von Silicycle-Kieselgel (40–63, 60 Å) oder EcoChrom-Kieselgel (12–26, 60 Å) durchgeführt. Es wurden destillierte Lösungsmittel technischer Qualität verwendet. Die angegebenen Ausbeuten beziehen sich auf chromatographisch gereinigte und spektroskopisch reine Verbindungen, sofern nicht anders angegeben.

1H-, 13C{1H}-, DEPTq-, COSY-, HSQC- und HMBC-NMR-Spektren wurden mit den Spektrometern Bruker DRX-500, AV-600 und AV-700 erhalten. Alle 1H-NMR-Spektren wurden relativ zu SiMe4 durch eine Resonanz des verwendeten deuterierten Lösungsmittels oder einer Verunreinigung des Lösungsmittels referenziert; Chloroform (7,26 ppm), DMSO (3,33 ppm) und Methanol (3,31 ppm) für 1H-NMR; Chloroform (77,00 ppm), DMSO (39,52 ppm) und Methanol (49,00 ppm) für 13C-NMR. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle NMR-Spektren bei RT (ca. 22 °C) aufgenommen. Die Daten werden als (s = Singulett, d = Dublett, t = Triplett, m = Multiplett oder unaufgelöst, br = breites Signal, Kopplungskonstante(n) in Hz, Integration) angegeben. 13C-NMR-Spektren wurden mit vollständiger 1H-Entkopplung aufgenommen. Servicemessungen wurden vom NMR-Serviceteam der Nuclear Magnetic Resonance Facility an der McMaster University von Dr. Bob Berno und Dr. Hilary A. Jenkins durchgeführt.

Massenspektrometrische Analysen wurden als hochauflösende ESI-Messungen auf einem Waters/Micromass QTof Global Ultima (Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometer) oder als hochauflösende EI in einem Waters/Micromass GCT-Instrument (Flugzeit-Massenspektrometer) durchgeführt vom Massenspektrometriedienst des McMaster Regional Center for Mass Spectrometry (MRCMS) an der McMaster University von Megan Fair und Leah Allan unter der Aufsicht von Dr. Kirk Green.

Die Enantiomerenverhältnisse wurden unter Verwendung einer Agilent 1220 Infinity HPLC-Handinjektion mit einem Detektor mit variabler Wellenlänge und einer Daicel Chiralpak® AD-H-Säule (150 × 4,6 mm, 5 µ) und n-Hexan/iPrOH (80:20) als mobile Phase bestimmt ; Flussrate 0,75 ml/min, Säulentemperatur 25 °C, λ236 nm, Probe 1 mg / 1 ml gelöst in der mobilen Phase.

Optische Drehungen wurden mit einem Perkin-Elmer 241 MC-Polarimeter gemessen, [α] wird in degcm3g−1 dm−1 und c in g cm−3 angegeben.

Menschliche iPSC-Linien (hiPSC), Subklon-Alias R139361416_SD und CR00427420_SA; RUCDR Infinite Biologics; Piscataway, New Jersey, USA) wurden in dieser Studie eingesetzt. Die iPSC-Linien R139361416_SD und CR00427420_SA wurden in dieser Studie als 01SD bzw. 9001 bezeichnet.

Humane iPSC-Zellen (hiPSCs) wurden vom Rutger's University Cell & DNA Repository (Piscataway, NJ, USA) bezogen. In der aktuellen Studie wurden keine menschlichen Teilnehmer/Daten/Proben verwendet. Alle Proben stammen aus einem öffentlichen Repository (RUCDR) und sind nicht identifiziert. HiPSCs wurden in mTeSR1-plus-Medium, ergänzt mit den dualen SMAD-Inhibitoren SB431542 (10 µM) und LDN193189 (100 nM) (NPS/Dual-SMAD), kultiviert, um die Neuroektodermbildung zu induzieren. Nach 8–10 Tagen wurden neurale Rosetten manuell isoliert, in Matrigel-beschichtete Platten übertragen und in StemDiff Neural Progenitor Medium (STEMCELL Technologies) zur Expansion von NPCs kultiviert.

Die humanen iPSC (hiPSC)-Linien 01SD und 9001 wurden zur Erzeugung gehirnähnlicher Organoide eingesetzt. Organoide wurden wie zuvor beschrieben (Ref) erzeugt, mit einigen Modifikationen im ersten Teil hinsichtlich der Erzeugung von Sphäroiden, die neurale Rosetten enthalten. Mit mTeSR™ plus Medium (STEMCELL Technologies) in Matrigel-beschichteten 6-Well-Platten kultivierte hiPSCs wurden mit Accutase abgelöst und dann durch vorsichtiges Pipettieren in Einzelzellsuspension dissoziiert. Sie wurden in 96-Well-Platten mit U-Boden und geringer Anhaftung in einer Dichte von 9000 Zellen/Well in mTeSR plus Medium, ergänzt mit Rho-assoziiertem Proteinkinase-Inhibitor (ROCK-Inhibitor) Y27632 (STEMCELL™), ausgesät, um Embryoidkörper (EBs) zu erzeugen. . Nach drei Tagen wurde das Medium zur Induktion von Neuroektoderm auf Essential 6-Medium (ThermoFisher Scientific) umgestellt, ergänzt mit den beiden SMAD-Inhibitoren SB431542 10 µM (MilliporeSigma S4317-5MG) und LDN193189 100 nM (MilliporeSigma SML055-9-25MG). Die Kulturen wurden beobachtet täglich.

Am 8. Tag wurden differenzierende EBs mit Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nährstoffmischung F-12 (DMEM/F12, Gibco 11330-032) gespült und in neuronalem Medium (DMEM/F12, ergänzt mit 1X MEM Nonessential Amino Acid Supplement (MEM-NEAA)) kultiviert , CORNING® 25–025-CI), 1X Glutamax (Gibco 35050-061), 1 × N2-Ergänzung (Gibco 17502-048) und 1 µg/ml Heparin (STEMCELL™ 07980)) in unbehandelten 10-cm-Petrischalen. Diese Platten wurden auf einem Orbitalschüttler im Inkubator bei 70 U/min (Orbi-Blotter™) platziert. Das Kulturmedium wurde alle drei Tage halbiert.

Am 20. Tag wurde das Kulturmedium durch kortikales Organoid-Differenzierungsmedium I (CODMI: DMEM:F12/Neurobasal (1:1 v/v) ergänzt mit 1X Glutamax, 1X B-27 (VitA[-]), 0,5X ersetzt Nicht-essentielle Aminosäuren, 0,5X N-2, Insulin (2,5 μg) und 1X Penicillin-Streptomycin (P/S). Am 25. Tag wurde das CODM-I-Medium durch kortikales Organoid-Differenzierungsmedium II (CODM-II: DMEM) ersetzt /F12-Neurobasal (1:1 v/v), ergänzt mit 1X Glutamax, 1X B-27 (VitA[+]), 0,5X nicht-essentielle Aminosäuren, 0,5X N-2, Insulin (2,5 μg), BDNF ( 10 ng/ml) und 1X P/S. Das Kulturmedium wurde alle 3 Tage gewechselt. Am Tag 42 wurde das CODM-II-Medium durch BrainPhys™ Neuronal-Medium (StemCell Technologies) ersetzt.

Monoschichtkulturen von NPCs wurden bei einer MOI von 0,1 mit einem rekombinanten HSV-1-Virus infiziert, der die Reportergene EGFP und RFP unter der Kontrolle der HSV-1-Promotoren ICP0 bzw. gC exprimierte (Ref). Zwei Stunden nach der Infektion wurden die Inokula entfernt, die Zellen gewaschen und in StemDiff Neural Progenitor Medium, ergänzt mit den oben beschriebenen Alkaloidanaloga in einer Konzentration von 10 μM oder ACV in einer Konzentration von 50 μM, kultiviert. Die Zellen wurden am Tag 3 pi mittels Durchflusszytometrie analysiert

Vierzehn Wochen alte Gehirnorganoide wurden einzeln in 96-Well-Platten mit U-Boden und niedriger Befestigung mit einem HSV-1-DualF-Konstrukt (6000 pfu/Organoid) infiziert. Nach 2 Stunden wurden die Inokula entfernt, die Organoide gewaschen und in BrainPhys-Medium, ergänzt mit den getesteten Verbindungen (10 μM) oder ACV (50 μM), kultiviert. Die Organoide, die in Gegenwart von ACV infiziert wurden, wurden 24 Stunden lang mit dem antiviralen Mittel vorbehandelt.

Die Lebensfähigkeit der Organoide wurde mithilfe des Calcein-AM-Assays (BioLegend; Katalog-Nr. 425201) gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert. Kurz gesagt, Organoide wurden einzeln in Eppendorf-Röhrchen mit 0,01 μM Calcein-AM exponiert und bei 37 °C inkubiert. Nach 20 Minuten wurden die Organoide in vorgewärmtes Kulturmedium überführt und weitere 10 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation wurden Fluoreszenzsignale mit einem LEICA DMIL LED-Fluoreszenzmikroskop durch ein 0,16 NA 4×-Luftobjektiv aufgezeichnet.

Die korrigierte Gesamtzellfluoreszenz (CTCF) wurde durch Messung der EGFP-Fluoreszenz in 799-behandelten und unbehandelten Organoiden und Normalisierung für die gesamte Organoidfläche unter Verwendung der Gleichung CTCF = integrierte Dichte − (gesamte Organoidfläche × mittlere Fluoreszenz der Hintergrundwerte) erhalten.

NPCs wurden in StemDiff Neural Progenitor Medium kultiviert, das die Verbindungen 2b, 8 (10 µM) oder Vehikel enthielt. Alle Tests wurden dreifach durchgeführt. Die Zellen wurden nach 72 Stunden geerntet und die zelluläre RNA extrahiert (RNeasy Mini Kits, Qiagen) und mit Agilent 4200 TapeStation (Agilent Technologies) quantifiziert. Gesamt-RNA-Bibliotheken wurden mithilfe des Illumina TruSeq Stranded Total RNA Sample Prepared Guide, Revision E, erstellt. Der erste Schritt umfasste die Entfernung ribosomaler und mitochondrialer RNA mithilfe biotinylierter, zielspezifischer Oligos in Kombination mit Ribo-Zero-rRNA-Entfernungskügelchen. Nach der Reinigung wurde die verbleibende RNA unter Verwendung zweiwertiger Kationen bei erhöhter Temperatur fragmentiert, die dann mithilfe von Reverse Transkriptase und Zufallsprimern in die Erststrang-cDNA kopiert wurden, gefolgt von der Zweitstrang-cDNA-Synthese unter Verwendung von DNA-Polymerase I und RNase H. Anschließend wurde eine einzelne Adenosinbase hergestellt zu jedem der cDNA-Fragmente hinzugefügt, gefolgt von der Ligation eines Adapters. Die Produkte wurden gereinigt und mittels PCR angereichert, um die endgültige cDNA-Bibliothek zu erstellen. Die cDNA-Bibliotheken wurden mit dem Primer-Premix-Kit von KAPA Biosystems mit Illumina-kompatiblen DNA-Primern und dem Qubit 2.0-Fluorimeter validiert. Die Qualität wurde mit einem Agilent Bioanalyzer Tapestation 2200 untersucht. Die cDNA-Bibliotheken wurden in einer Endkonzentration von 1,8 pM gepoolt. Die Clustergenerierung und die 100-bp-Paired-Read-Dual-Index-Sequenzierung wurden auf Illumina NextSeq 500 (Kinderkrankenhaus Pittsburgh, Universität Pittsburgh) durchgeführt.

Die Lesequalität der Sequenzierung wurde mit der Software fastQC v0.11.4 und CLCbio v11.0.1 bewertet. Die durchschnittliche Anzahl der Lesevorgänge pro Probe betrug 39,5 Millionen (SD = 4,8 Millionen Lesevorgänge). Die Sequenzen wurden basierend auf dem Qualitätsfaktor unter Verwendung des modifizierten Mott-Trimmalgorithmus, wie er in der CLC-Bio-Software implementiert ist, unter Verwendung einer Trimm-Cutoff-Fehlerwahrscheinlichkeit von 0,05 getrimmt. Mehrdeutige Basen wurden unter Verwendung eines maximalen mehrdeutigen Basen-Cutoffs von 2 nach dem Trimmen getrimmt. Die getrimmten Lesevorgänge wurden dann unter Verwendung der von Ensembl (Version 82) bereitgestellten Sequenz und Annotation auf das menschliche Genom GRCh38/hg38 abgebildet. Ungefähr 92 % der Lesevorgänge wurden in allen Proben paarweise zugeordnet (SD = 1,14), und 97,7 % der Lesevorgänge wurden insgesamt zugeordnet (SD = 0,45). Die Daten wurden in der Gene Expression Omnibus-Datenbank des NCBI (GSE201156) hinterlegt.

Quantitative Reverse-Transkriptions-PCR (qRT-PCR) wurde verwendet, um die Genexpressionsanalyse mithilfe von Taqman-Assays (Thermo Fisher, USA) zu bestimmen, die spezifisch für die Gene TP53 (ID Hs01034249_m1), SIRT1 (Hs01009006_m1) und BCL2 (Hs00608023_m1) sowie ATF4 mit dem Primersatz FWD sind 5′TCAAACCTCATGGGTTCTCC3′ und REV: 5′GTGTCATCCAACGTGGTCAG3′. Jede Probe hatte 3 oder 4 biologische Replikate. Die Reverse-Transkriptionsreaktion wurde aus 100 ng Gesamt-RNA unter Verwendung von Zufallshexameren und SuperScript IV (Thermo Fisher) durchgeführt. Die Bedingungen für die RT-Reaktion waren ein 5-minütiges Priming bei 65 °C, anschließend 10 min bei 55 °C und 10 min bei 80 °C; dann auf 4 °C gehalten. 2 μl verdünnte cDNA (1:3) wurden zu Luna Universal Probe qPCR Master Mix oder Luna Universal qPCR Master Mix (NBE, USA) zu einem Gesamtvolumen von 10 μl gegeben. Die PCR wurde in CFX96 (BioRad, USA) unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 60 s lang bei 95 °C, gefolgt von 40 Zyklen 15 s lang bei 95 °C und 1 Minute lang bei 30 °C. Die Genexpressionsniveaus wurden mithilfe von Ct (Schwellenzyklus) bestimmt. Der ∆Ct wurde berechnet, indem der Ct von GAPDH (FWD: 5'ACCCACTCCTCCACCTTTG3′, REV: 5′CTCTTGTGCTCTTGCTGG3′) vom Ct-of-Interest-Gen subtrahiert wurde. ∆∆C wurde berechnet, indem ∆C der Referenzprobe vom ∆C der Kontrollproben subtrahiert wurde. Die Faltungsänderung wurde durch die folgende Gleichung dargestellt: 2−ΔΔ Ct.

ND4-Swiss-Mäuse im Alter von 4 bis 6 Wochen (Envigo-Labors) wurden über das Auge infiziert. Mäuse wurden mit Isofluran anästhesiert und die Hornhaut wurde mit einem 23-ga-Gerät leicht skarifiziert. Nadel. 1 × 105 pfu (in 5 µl) HSV-1-Stamm 17syn+ wurde auf die Hornhautoberfläche aufgetragen. Gleichzeitig wurde eine Gruppe von Mäusen (n = 10) mit 2 µL einer 50 µM Lösung von Verbindung 8 in DMSO und die andere Gruppe (n = 10) mit 2 µL DMSO (Vehikel) behandelt, aufgetragen auf die Augen. Die Augen wurden 4 Tage lang jeden Tag entweder mit Vehikel oder Verbindung 8 behandelt. Um die Wirkung von Verbindung 8 auf den Infektionsverlauf zu beurteilen, wurden die Augen täglich mit einem Dacron-Tupfer abgewischt und das Virus in MEM-Medium eluiert. Das Abstricheluat wurde mittels Standard-Plaque-Assay auf Kaninchenhautzell-Monoschichten auf das Vorhandensein infektiöser Viren untersucht.

Alle statistischen Analysen wurden in GraphPad Prism 9 durchgeführt. Einweg-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von einer Post-hoc-Analyse für die in den Abbildungen gezeigte Analyse. 1, 3 und 5 (Einzelheiten siehe Abbildungen).

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Wir danken NSERC für einen Discovery Research Grant (JMcN), dem Stanley Medical Research Institute 13R-002 (JMcN) und dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) 1R01NS115082-01A1 und 1R21NS096405-01A1 (LDA) für finanzielle Unterstützung. PRK dankt für die Unterstützung von EY08098, Research to Prevent Blindness Inc, NY und der Eye & Ear Foundation of Pittsburgh.

Abteilung für Chemie und chemische Biologie, McMaster University, Hamilton, ON, L8S 4M1, Kanada

James McNulty, Chanti Babu-Dokuburra, Jon Scattolon und Carlos Zepeda-Velazquez

Abteilung für Psychiatrie, Western Psychiatric Institute and Clinic, University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, PA, 15213, USA

Maribeth A. Wesesky, Jill K. Caldwell, Wenxiao Zheng, Vishwajit L. Nimgaonkar und Leonardo D'Aiuto

Abteilung für Augenheilkunde, University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, PA, USA

Paul R. Kinchington

Abteilung für Molekulare Mikrobiologie und Genetik, Universität Pittsburgh, Pittsburgh, PA, USA

Paul R. Kinchington

Abteilung für Molekulargenetik und Mikrobiologie, College of Medicine, University of Florida, Gainesville, FL, 32610, USA

David C. Bloom

Zweites Xiangya-Krankenhaus, Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha, China

Wenxiao Zheng

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Jadranka Milosevic

Capture Diagnostics Inc, Pittsburgh, PA, USA

Jadranka Milosevic

Veterans Administration Pittsburgh Healthcare System, 4100 Allequippa St (University Drive C), Pittsburgh, PA, 15240, USA

Vishwajit L. Nimgaonkar

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J.McN.: Korrespondierender Autor: Dr. McNulty konzipierte und entwarf die synthetische organische Chemie, interpretierte Daten, schrieb Manuskripte und beschaffte Gelder für das Studium. LD: Korrespondierender Autor: Dr. D'Aiuto konzipierte die antiviralen Studien, entwickelte Protokolle unter Verwendung von iPSCs, RNA-Sequenzierungsanalyse und Dateninterpretation und schrieb Manuskripte. CBD, JS und CZV führten die Synthese aller Alkaloidderivate und deren Charakterisierung durch. MAW, JKC, WZ, PRK und JM führten antivirale Studien durch und halfen bei der Datenanalyse und -interpretation. VLN konzipierte antivirale Experimente, beschaffte Gelder für Studien und verfasste Manuskripte. DCB führte in vivo antivirale Studien durch, half bei der Dateninterpretation und verfasste ein Manuskript. Wir danken Herrn Joel Wood für die RNASeq-Datenanalyse.

Korrespondenz mit James McNulty oder Leonardo D'Aiuto.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

McNulty, J., Babu-Dokuburra, C., Scattolon, J. et al. Das verkürzte Ring-A-Amaryllidaceae-Alkaloid moduliert die integrierte Stressreaktion der Wirtszelle und zeigt antivirale Aktivität gegen HSV-1 und SARSCoV-2. Sci Rep 13, 1639 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28691-0

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Eingegangen: 11. August 2022

Angenommen: 23. Januar 2023

Veröffentlicht: 30. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28691-0

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