Strukturoptimierung eines neuen Tumors

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 22390 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die selektive Beseitigung von Tumoren war schon immer das Hauptthema der onkologischen Forschung. Die laufende Forschung, die den zellulären apoptotischen Mechanismen zugrunde liegt, zeigt, dass die Aktivierung von Caspasen, insbesondere des Schlüsseleffektors Caspase-3, eine personalisierte tumorselektive Therapiestrategie ist. Unser fortlaufendes Forschungsprotokoll hat neue optimierte Passerini-α-Acyloxycarboxamide als effiziente apoptotische Induktoren über einen Caspase-3/7-abhängigen Mechanismus mit hochselektiven Antikrebsprofilen genutzt. Das angenommene Designprinzip beruhte darauf, strukturelle Alarme früherer Leitstrukturen auszuschließen und gleichzeitig verschiedene pharmakophore Motive natürlicher und synthetischer Caspase-Aktivatoren über optimierte Eintopf-Passerini-Reaktionsbedingungen zu vereinen. Die aus der Passerini-Reaktion hergestellten Verbindungen wurden mittels MTT-Assay auf ihre zytotoxischen Aktivitäten gegen kolorektale Caco-2- und Leber-HepG-2-Krebszellen im Vergleich zu normalen Fibroblasten untersucht. Bemerkenswerterweise zeigten alle Verbindungen einen vielversprechenden niedrigen submikromolaren IC50-Wert gegen die untersuchten Krebszelllinien mit hervorragender Tumorselektivität (SI-Werte bis zu 266). Daher waren sie 5-Fluorouracil überlegen. Bemerkenswerterweise verliehen 7a, 7g und 7j die höchsten Wirksamkeiten gegen Caco-2- und HepG-2-Zellen und wurden für weitere mechanistische Studien ausgewählt. Der Caspas-3/7-Aktivierungstest der Trefferverbindungen und die durchflusszytometrische Analyse der behandelten apoptotischen Krebszellen zeigten deren signifikantes Caspase-Aktivierungspotenzial (bis zum 4,2-fachen) und apoptotische Induktionskapazitäten (bis zu 58,7 %). Eine weitere Bewertung der Bcl2-Expression wurde als physiologisches Caspase-3-Substrat durchgeführt. Dabei konnten die drei untersuchten Passerini-Addukte Bcl2 in den behandelten Caco-2-Zellen herunterregulieren. Wichtig ist, dass die mechanistischen Studienergebnisse der drei Treffer ihre vorläufigen MTT-Daten zur antiproliferativen Potenz widerspiegelten und ihre Caspase-3-abhängige apoptotische Induktion hervorhoben. Schließlich waren die in silico vorhergesagten physikochemischen und pharmakokinetischen Profile sowie die Ligandeneffizienzmetriken arzneimittelähnlich.

Die Umgehung der Apoptose, dem normalen programmierten Zelltodprozess, der die Gewebehomöostase1 aufrechterhält, ist ein Kennzeichen von Krebs2,3. Apoptose wird durch eine Kaskade intrinsischer und extrinsischer Signalwege vermittelt, die hauptsächlich auf der Caspase-abhängigen Proteolyse zahlreicher lebenswichtiger Proteine, der DNA-Spaltung und der Bildung von Membranbläschen beruhen4. Caspasen umfassen eine charakteristische Familie von Cysteinyl-Aspartat-spezifischen Proteasen, die in der Lage sind, einen Aspartat-Aminosäurerest von ihren spezifischen Substraten abzuspalten5,6 und so einen irreversiblen Zelltod herbeizuführen. Caspasen werden in Initiatorgruppen (Caspase-10, -9, -8 und -2) und Effektorgruppen (Caspase-7, -6 und -3) eingeteilt7. Caspase-3 und -7 gelten als die wichtigsten Effektor-Caspasen, die Apoptose ausführen8,9,10. Diese Erkenntnisse veranlassten Krebsforschungsprogramme daher dazu, die Caspasenfamilie, insbesondere die Effektormitglieder, als attraktive Antikrebsziele für die Induktion der Apoptose-Induktion in Krebszellen zu etablieren11. Darüber hinaus sind die zellulären Konzentrationen von Procaspasen, den inaktiven Vorläufern von Effektor-Caspasen, bei Krebs im Vergleich zu normalem Gewebe normalerweise erhöht, was eine ideale Gelegenheit für das Tumor-Targeting darstellt, selektiv zytotoxische Caspasen bei Krebs zu erzeugen, indem die Überexpression von Procaspasen als Waffe eingesetzt wird. Dementsprechend gilt die Caspase-vermittelte apoptotische Induktion als hochgradig tumorselektive Antikrebsstrategie12. Da reife Caspasen durch den zellulären Inhibitor von Apoptoseproteinen (IAPs) gehemmt werden, die im Wesentlichen durch den sekundären Mitochondrien-Aktivator von Caspasen (SMAC/Diablo) inaktiviert werden7, konzentrierten sich frühe Arzneimittelforschungsstudien auf SMAC, das Caspase-abhängige Apoptose auslöst13. 14. Seine direkte klinische Anwendung wurde jedoch durch die Nachteile seiner Peptidnatur erschwert. Als Hauptmotiv für die Entwicklung von Peptidmimetika, die als endogenes Protein fungieren können, wurde dann ein Tetrapeptid von SMAC in Betracht gezogen. Pionierstudien führten eine Reihe effizienter apoptotischer Induktoren ein, die als verkappte Tripeptide konzipiert sind, um ihren Peptidcharakter zu reduzieren (Abb. 1; I und II)16. Diese aktive Forschung spiegelte sich in mehreren Versuchen zur Optimierung neuartiger niedermolekularer Caspase-abhängiger apoptotischer Induktoren wider. Frühe Studien mit Hochdurchsatz-Screening-Caspase-basierten Assays führten eine neue Reihe wirksamer Caspase-Aktivatoren ein, die von Nicotinamiden III abgeleitet sind (Abb. 1)16. Weitere fruchtbare Arbeiten führten dazu, dass verschiedene Caspase-Aktivatoren im präklinischen Stadium eingeführt wurden17,18. Optimierte fragmentbasierte Designstudien identifizierten nichtpeptidische apoptotische Induktoren im klinischen Stadium, die auf einem essentiellen Amidkern basieren (Abb. 1, IV), der für die Aktivität entscheidend ist und nicht verändert oder entfernt werden sollte19. In diesem Sinne hat unsere Forschungsgruppe den Mehrkomponenten-Passerini-3CR als Gesichtssynthesestrategie genutzt, um Bibliotheken von Caspase-Aktivator-Induktoren V (Abb. 1)20 auf Amidbasis zu synthetisieren, die die thematischen Strukturmerkmale von Leitverbindungen berücksichtigen (Abb. 1). Unter den untersuchten Serien zeigten die Hit-Derivate eine ausgeprägte krebshemmende Wirksamkeit gegen verschiedene Krebsarten beim Menschen20.

Blei-Caspase-Aktivatoren für kleine Moleküle.

Hierin setzten wir unser Optimierungsprotokoll unter Verwendung des führenden Passerini-Gerüsts fort (Abb. 2). Erstens wurden die neu synthetisierten α-Acyloxycarboxamide so konzipiert, dass sie als Ersatz für die Nitrogruppe einen Ester in das Amid-Gegenstück einbauen, was ein struktureller Alarm und ein möglicher Toxikophor ist21,22 mit dem Ziel, das Sicherheitsprofil und die Antikrebsselektivität des Moleküls zu verbessern. Zweitens wurde das Acyloxy-Gegenstück rational ausgewählt, inspiriert von pharmakophoren Motiven natürlicher Caspase-Aktivatoren, bei denen Indol- und Chinolinringe in das Gerüst eingebaut wurden, die die Hauptkerne mariner Bisindolalkaloide23,24 aus der 3,3′-Diindolylmethan (DIM)-Familie25 sind Chinolinalkaloide23. Um schließlich möglicherweise „die molekulare Fettleibigkeit“ für eine bessere Pharmakokinetik zu begrenzen und den abgeleiteten SAR in dieser Studie anzureichern, wurde eine Strukturvereinfachungsstrategie übernommen, bei der die heterozyklischen Acyloxy-Gegenstücke zu verschiedenen Aromaten (Benzoat, Phenylacetat und Cinnamat) vereinfacht wurden aliphatische (Thioglycolat-)Einheiten. Im Rahmen des verfolgten Mimikry-Design-Ansatzes wurden verschiedene Substituenten ausgewählt, die den gemeldeten Leitmolekülen Caspase-abhängige Antitumoraktivitäten verliehen, darunter Halogene20 und Thiolgruppen26.

Designprinzipien der Ziel-Passerini-Addukte.

Alle Ziel-Passerini-Addukte wurden zunächst mit dem MTT-Assay27 gegen menschliche Fibroblasten Wi-38 auf ihr zytotoxisches Potenzial gegen menschliche Fibroblasten (Wi-38) und zwei Krebszelllinien, nämlich HepG-2 (Leber) und Caco-2 (Dickdarm), gescreent gehört laut der aktualisierten WHO-Liste28 zu den häufigsten Krebsarten weltweit. Die Selektivität gegenüber Krebszellen im Vergleich zu normalen Zellen wurde bewertet. Für die vielversprechendsten Verbindungen wurden ein Aktivierungstest für Caspase-3/7 und eine durchflusszytometrische Analyse der Apoptose durchgeführt. Weitere Apoptosestudien wurden durchgeführt, um die Expression von Bcl2, einem physiologischen Caspase-3-Substrat, zu quantifizieren29. Anschließend wurden die ausgewählten Verbindungen rechnerischen Studien unterzogen, um ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften, ADME-Parameter und Effizienzmetriken vorherzusagen.

Mehrkomponentenreaktionen (MCRs) haben sich aufgrund ihrer Effizienz bei der Bindungsbildung zu hervorragenden Verfahren in organischen Studien entwickelt, da drei oder mehr Komponenten in der Eintopfsynthese miteinander reagieren, um höhere Ausbeuten an reinen Produkten, eine höhere Reaktionsgeschwindigkeit, eine bessere Selektivität und eine einfachere Handhabung zu erzielen. schnelle Optimierung der Reaktion, Wirkungsfähigkeit, chemo-, regio- und stereoselektive Transformationen, wirtschaftliche und umweltfreundliche Prozesse. Isocyanid-basierte Mehrkomponentenreaktionen (IMCRs) sind eines der wichtigsten Gebiete des letzten Jahrzehnts. IMCRs stellen aufgrund ihrer vielseitigen biologischen Eigenschaften einen interessanten Abschluss von Mehrkomponentenreaktionen dar. Darüber hinaus waren sie nützlich für die Bildung neuer, komplexer und biologisch aktiver Verbindungen30,31.

Mario Passerini führte die erste IMCR durch, indem er drei Komponenten (ein Isocyanid, eine Carbonsäure und eine Oxoverbindung) kombinierte, um α-Acyloxycarboxamide zu bilden. Passerini-Produkte sind Gerüste, die zur Synthese großer Bibliotheken bioaktiver Arzneimittel verwendet wurden32,33.

Neuartig synthetisierte α-Acyloxycarboxamide haben bei verschiedenen menschlichen Krebszelllinien zytotoxische Aktivitäten gezeigt. Über die Dreikomponenten-Passerini-Reaktion wurde zuvor unter Verwendung von p-Nitrophenylisocyanid berichtet, bei dem die Nitrogruppe als elektronenziehende Gruppe mit Cyclohexanon und verschiedenen Carbonsäuren fungierte. Auch unerwartete Produkte, die durch Verwendung von Trifluor- und Trichloressigsäure unter Bildung von Hydroxy- bzw. Spiroverbindungen erhalten werden. In diesem Zusammenhang berichten wir hier über die Passerini-Reaktion zwischen Ethyl-4-isocyanobenzoat 4 mit den Carbonsäurederivaten 5a–k und Cyclohexanon 6, die biologisch aktive Produkte bildet20.

Hier unsere Strategie zur Durchführung der Passerini-Reaktion unter Verwendung des Isocyanids 4, das durch Durchführung einer Veresterungsreaktion von 4-Aminobenzoesäure (1) unter Rückfluss in absolutem Ethanol synthetisiert wurde, um den entsprechenden Ester 4-Aminoethylbenzoat (2) zu ergeben. welches als Benzocain-Medikament bekannt ist und als Schmerzmittel eingesetzt wird34. Folglich erfolgte die Formylierung des letzteren unter Verwendung von Ameisensäure und Toluol, um 4-Formamidoethylbenzoat (3)35 zu ergeben, gefolgt von einer Dehydratisierung unter Verwendung des PPh3/Et3N/I2-Protokolls, wobei die Reaktion 1 Stunde lang durchgeführt wurde, um das entsprechende Isonitrilethyl-4-isocyanobenzoat zu ergeben (4) in guter Ausbeute36 (Abb. 3). Das gebildete Isocyanid ist instabil und sollte vorzugsweise bei niedriger Temperatur (5–10 °C) gelagert werden. Die Struktur von 4 wurde durch IR bestätigt, das eine starke Bande bei 2124 und 1717 cm−1 zeigte, die die Isocyano- bzw. Carbonylgruppe der Estergruppen charakterisiert.

Synthese von Ethyl-4-isocyanobenzoat 4.

Eine neuartige Reihe der α-Acyloxycarboxamid-Derivate 7a–k wurde über die Passerini-Reaktion unter Verwendung von 4 im Überschuss an Cyclohexanon als Keton und Lösungsmittel mit verschiedenen Carbonsäuren, nämlich Indol-3-essigsäure, Chinaldinsäure, Benzoesäure und p-Chlorbenzoesäure, hergestellt Säure, o-Chlorbenzoesäure, o-Iodbenzoesäure, Phenylessigsäure, (E)-3-(4-(trifluormethyl)zimtsäure, N-Boc-4-aminohippursäure, (Phenoxycarbonyl)-l-phenylalanin und 2- Mercaptoessigsäure 5a–k; bei Raumtemperatur (Abb. 4). Die erhaltenen Passerini-Derivate wurden detailliert durch FT-IR- und NMR-Spektroskopie analysiert. Das 1H-NMR-Spektrum von 7a–k zeigte Signale für –NH in resonierenden Amidogruppen von δH 10,9–8,9 ppm. Die zehn Protonen der c-Hexylidengruppe erschienen auch im Bereich von δH 3,1–1,1 ppm. Das Proton der –NH-Indolgruppe 7a zeigte ein Singulettsignal bei δH 10,94 ppm. Außerdem zwei Protonen der –CH2-Gruppe (CO-CH2-Ar) für Verbindung 7g erschien als Singulettsignal bei δH 3,78 ppm. Das Protonenspektrum für Verbindung 7h zeichnete zwei Signale auf, die olefinischen Wasserstoffen bei δH 7,71 und 6,86 ppm entsprachen. Drei Amidprotonen für Produkt 7i zeigten drei Signale bei δH 9,74, 9,62 und 8,90 ppm. Für Produkt 7j zeichneten drei Protonen der l-Phenylalanin-Einheit Signale bei δH 4,95 ppm für –CH2 und bei δH 4,44–4,39 ppm für –CH auf. Das Proton der Mercapto-Gruppe –SH in 7k zeigte Resonanzsignale von δH 0,85–0,80 ppm. Die im 13C-NMR-Spektrum aufgezeichneten Signale resonierten bei δc 171,8–161,2 ppm und entsprachen Amido- bzw. Ester-CO-Gruppen. Kohlenstoffe von c-Hexyliden (O–C–CO), die im Bereich von δc 84,0–81,1 ppm schwingen. Außerdem zeichneten Cyclohexylkohlenstoffe Signale mit einem Resonanzwert von δc 36,0–20,6 ppm auf. Für die Produkte 7f und 7k zeigten die Kohlenstoffe von CI und CH2-SH Signale, die bei δc 94,7 bzw. 40,7 ppm aufgezeichnet wurden.

Synthese der α-Acyloxycarboxamid-Derivate 7a–k mittels Passerini-Reaktion.

(P-3CR) unter Verwendung von Trihalogenessigsäuren über die Passerini-Reaktion zeigte unerwartete Derivate. Dabei lieferte Trifluoressigsäure (TFA) Ethyl-4-(1-hydroxycyclohexancarboxamido)benzoat 9 in guter Ausbeute, nachdem das gebildete Passerini-Produkt Ethyl-4-(1-(2,2,2-trifluoracetoxy)cyclohexancarboxamido)benzoat 8 hydrolysiert wurde (Abb. 5). Das 1H-NMR-Spektrum bestätigte die Struktur von 9, wobei zwei Protonen, die dem Amid (NH) und der Hydroxylgruppe (OH) entsprechen, deutlich als zwei Singulettsignale bei δH 9,91 bzw. 5,49 ppm auftraten. Außerdem zeigte das 13C-NMR-Spektrum Signale für Carbonyl der Amidgruppe und Kohlenstoffe des tertiären Alkohols bei δc 177,1 bzw. 74,5 ppm.

Synthese von 9 und 11 mittels Passerini-Reaktion unter Verwendung von Trihalogenessigsäuren.

Alternativ ergab P-3CR unter Verwendung von Trichloressigsäure (TCA) die unerwartete Spiroverbindung; Ethyl-4-(2,4-dioxo-1-oxa-3-azaspiro[4,5]decan-3-yl)benzoat (11), wobei Passerini-Produkt; Zuerst wurde Ethyl-4-(1-(2,2,2-trichloracetoxy)cyclohexancarboxamido)benzoat 10 gebildet, dann wurde die –CCl3-Gruppe durch intramolekularen nukleophilen Stickstoffangriff auf die Trichloracetylgruppe freigesetzt, gefolgt von der Cyclisierung zur Bildung von 11 (Abb. 5). . 1H-NMR bestätigte die Struktur von 11, wobei Protonen der aromatischen Einheit zwei offensichtliche Dublettsignale bei δH 8,06 und 7,62 ppm aufzeichneten. Darüber hinaus erschienen c-Hexyliden-Protonensignale bei δH 2,04 und 1,30 ppm. 13C-NMR bestätigte das Spirokohlenstoffsignal bei δc 85,0 ppm. Außerdem zeichneten die CO-Gruppen des Oxazolindionrings zwei Signale bei δc 174,0 und 152,8 ppm auf.

In Bezug auf die Stabilität der derzeit untersuchten Passerini-Addukte ergab die Literaturrecherche eine aktuelle wertvolle Studie, die zeigt, dass die Stabilität des Esters im Passerini-Gerüst durch andere vorhandene Substrukturen beeinflusst werden könnte, basierend auf Experimenten, die an einer Bibliothek von mehr als Passerini-Addukten durchgeführt wurden37. Die Studie befasste sich mit den Anwendungen der Passerini-Reaktion in der medizinischen Chemie und konzentrierte sich auf die Untersuchung der metabolischen Stabilität des Gerüsts gegenüber Esterasen. Wenn dementsprechend die direkt an die Estereinheit (R3; Abb. 6) gebundene Gruppe ein ortho-substituierter oder ortho, ortho′-disubstituierter aromatischer Ring ist, sind die Passerini-α-Acyloxycarboxamide metabolisch stabil gegenüber Esterasen37.

Die allgemeine Struktur der Passerini-α-Acyloxycarboxamide.

Dies steht im Einklang mit früheren Studien, die im Allgemeinen zeigten, dass sterische Hinderung die hydrolytische Aktivität von Esterasen verringern oder unterdrücken kann, während das Vorhandensein elektronenziehender Gruppen auf der Acylseite die enzymatische Spaltung erleichtern kann38. Der Skelettester ist auch gegenüber Hydrolyse stabil, wenn die R1-Gruppe ein sperriger Substituent ist, unabhängig von der Art des R3-Substituenten. Die Studie wurde auch auf die Stabilität des terminalen aromatischen Esters hingewiesen, wie beispielsweise durch experimentelle Beobachtung der unterschiedlichen Hydrolysestabilitäten von Methylbenzoat und Methyl-2,6-Dimethylbenzoat gegenüber Esterasen, wobei ersteres leicht hydrolysiert wird, während letzteres völlig resistent ist Esterasen37.

Die neu synthetisierten Passerini-Addukte 7a–k wurden vorab mithilfe des Mikrokultur-MTT-Assays39 gescreent, um ihre potenziellen antiproliferativen Aktivitäten gegen normale menschliche Fibroblasten (Wi-38), kolorektale (Caco-2) und hepatozelluläre (HepG-2) Krebszellen im Vergleich zu zu bewerten Standard-Chemotherapie 5-Fluorouracil, die Caspase-abhängige Apoptose bei verschiedenen Krebsarten fördert40,41 (Tabelle 1). Offensichtlich waren alle Derivate 5-Fluorouracil gegenüber den gescreenten Zelllinien hinsichtlich Wirksamkeit und Selektivität überlegen. 7g wurde als das wirksamste (IC50 = 0,06 μM) und selektivste (SI = 262–266) Passerini-Addukt gegen die gescreenten Zelllinien eingestuft, gefolgt von 7j und 7a (IC50 = 0,07–0,12 μM, SI = 97–243). 7e, 7f, 7i und 9 zeigten eine etwas geringere Wirksamkeit und verzeichneten vergleichbare submikromolare IC50-Werte im niedrigen Bereich. Diese Derivate waren mit SI-Werten zwischen 69 und 180 besonders tumorselektiv. Die übrigen Derivate waren relativ weniger aktiv, aber hinsichtlich Wirksamkeit und Selektivität immer noch vielversprechend.

Erwähnenswert ist, dass das beobachtete Zytotoxizitätsmuster der untersuchten Passerini-Ester ihr vielversprechendes Tumorselektivitätsprofil unterstreicht. Dies ließe sich sicher ableiten, wenn man sie mit den Zytotoxizitätsprofilen der zuvor untersuchten Passerini-Leitmoleküle mit Nitrogruppensubstituenten vergleicht20, wie anhand der MTT-Assaydaten der in Abb. 7 dargestellten strukturell verwandten Derivate veranschaulicht. Es ist offensichtlich, dass ein einfacher Austausch der Nitrogruppe durch Eine Estereinheit verbesserte das Tumorselektivitätsprofil des Passerini-Gerüsts um etwa das 85-fache, was ihre höhere Sicherheit gegenüber normalen Zellen widerspiegelt.

Die Auswirkung der Substitution der Nitrogruppe durch Ester auf das Zytotoxizitätsprofil des Passerini-Gerüsts.

Interessanterweise rechtfertigte diese Beobachtung unsere Designstrategie und unser Optimierungsprotokoll, indem wir die als strukturelle Warnung angesehene Nitrogruppe durch die biokompatible Estergruppe ersetzten.

Der Caspase-3/7-Aktivierungstest20,42 wurde an den aktivsten Antikrebsderivaten durchgeführt, um die relativen Anstiege der Caspase-3/7-Aktivität in HepG-2- und Caco-2-Zellen nach Behandlung mit IC50-Dosen (Tabelle 1) der untersuchten Personen aufzuzeichnen Verbindungen. Die Ergebnisse (Tabelle 2) zeigten, dass die drei Verbindungen Caspase-3/7 aktivierten und die Apoptose von Krebszellen induzierten. In Caco-2-Zellen wurden etwas höhere Aktivierungspotentiale (3,08–4,18-fach) im Vergleich zu HepG-2 (2,94–4,11-fach) festgestellt. Das stärkste antiproliferative Passerini-Addukt 7g zeigte in den untersuchten Krebszellen im Vergleich zu den anderen Derivaten 7j, 7a bzw. dem Referenzarzneimittel die höchsten relativen Caspase-3/7-fachen Zuwächse (bis zu 4,17). Diese Ergebnisse stimmten mit den Ergebnissen des MTT-Tests überein (Tabelle 1). Daher könnte postuliert werden, dass die durch Caspase-3/7 vermittelte apoptotische Induktion der mögliche antiproliferative Mechanismus der untersuchten Verbindungen sein könnte.

Das Bcl2-Protein hemmt die Apoptose und wird normalerweise während der Apoptose durch Caspasen oder in vitro durch rekombinante Caspase-329 an Asp-34 gespalten. Darüber hinaus zeigten mehrere Studien, dass die Bcl2-Expression in verschiedenen Geweben aufgrund der Caspase-3-Aktivierung43 und umgekehrt44 herunterreguliert wird. In dieser Studie zeigte die RT-qPCR von Bcl2-Ergebnissen, dass die untersuchten Verbindungen die Bcl2-Expression um mehr als das Zehnfache unterdrücken konnten 5-FU-behandelte Caco-2-Zellen (Tabelle 3). 7g zeigte das höchste Potenzial für eine 11,5-fache Herunterregulierung von Bcl2, gefolgt von 7j und 7a.

Caco-2- und HepG-2-Zellen, die mit den Hit-Derivaten 7a, 7g und 7j behandelt wurden, wurden nach 72 Stunden mikroskopisch untersucht und mit unbehandelten und 5-FU-behandelten Zellen verglichen (Abb. 8). Wie gezeigt, zeigten die mit Hit-Verbindungen behandelten Zellen eine starke Schrumpfung und morphologische Veränderungen, was auf antiproliferative Aktivitäten und hohe apoptotische Induktionskapazitäten der untersuchten Addukte hinweist.

Morphologische Veränderungen der mit den Hit-Verbindungen 7a, 7g und 7j behandelten Krebszelllinien nach 72 Stunden, unbehandelter Krebszellen und mit 5-Fluororuracil behandelter Zellen.

Eine durchflusszytometrische Analyse wurde an Annexin-gefärbten apoptotischen Caco-2-Zellen durchgeführt, die 72 Stunden lang mit IC50-Dosen der Hit-Derivate 7a, 7g und 7j behandelt wurden. Für die Studie wurden Caco-2-Zellen ausgewählt, die im Vergleich zu HepG-2-Zellen empfindlicher auf das Caspase-abhängige apoptotische Potenzial der untersuchten Verbindungen reagieren. Die Ergebnisse zeigten, dass unsere effizienten Caspase-Aktivatoren die Apoptose von Krebszellen um ≥ 51 % induzierten. Der aktivste Caspase-Aktivator 7g zeigte das höchste apoptotische Induktionspotenzial, wie durch 58,7 % der gesamten apoptotischen Zellpopulation in den behandelten Zellen angezeigt, gefolgt von 7j (52,6 %) bzw. 7a (50,9 %), verglichen mit der unbehandelten Kontrolle (1,8 %). ), wie in Tabelle 4 und Abb. 9 gezeigt. Interessanterweise konnten die nachgewiesenen Wirksamkeiten mit den Ergebnissen von MTT- und Caspase-Aktivierungstests korreliert werden.

Durchflusszytometrische Analyse der Apoptose-Induktion in mit den aktivsten Verbindungen behandelten Caco-2 im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen nach Färbung mit Annexin V/Propidiumiodid.

Als nützliches Instrument zur Identifizierung von Liganden werden in der Regel Computerstudien durchgeführt, um die Ligandeneffizienzmetriken, physikochemischen und pharmakokinetischen Parameter sowie die Arzneimittelähnlichkeit der vielversprechendsten Verbindungen vorherzusagen. In der aktuellen Studie wurden die Metriken der Ligandeneffizienz (LE) und der lipophilen Ligandeneffizienz (LLE) der vielversprechendsten Caspase-Aktivatoren 7a, 7g und 7j wie berichtet berechnet (Tabelle 5)20,45,46. LE stellt das Gleichgewicht zwischen Molekülgröße und Wirksamkeit dar47,48,49, während LLE veranschaulicht, wie effizient der Wirkstoff seinen lipophilen Charakter ausnutzt, um Wirksamkeit auszuüben50. Dementsprechend könnten die Trefferverbindungen zuverlässiger priorisiert werden, korrigiert um ihre Molekülgröße und Lipophilie.

Die Ergebnisse (Tabelle 5) zeigten vielversprechende LE- und LLE-Kennzahlen der untersuchten Verbindungen. 7 g überschritten den akzeptablen LE-Grenzwert gegenüber den gescreenten Zelllinien. 7a lag leicht über der unteren LE-Grenze, während 7j den niedrigsten vorhergesagten LE-Wert in der Gruppe aufwies. Interessanterweise verzeichneten die drei Verbindungen bleiähnliche LLE-Werte im Bereich von 3,36 bis 4,02.

Wichtig ist, dass die physikochemischen Eigenschaften, die die Fünferregel von Lipinski51, die Bioverfügbarkeitsparameter von Veber und Egan52,53 formulieren, mithilfe des SwissADME-Webtools54 berechnet wurden, um die vorhergesagte Arzneimittelähnlichkeit der untersuchten Verbindungen zu bewerten. Die Ergebnisse (Tabelle 6) zeigten, dass die drei Verbindungen vollständig mit Egans Parametern übereinstimmten. 7a und 7g erfüllten die Parameter von Lipinski und Veber, im Gegensatz zu 7j, das die Molekulargewichtsgrenze von Lipinski und die Anzahl der Rotoren von Veber verletzte. Auch die topologische polare Oberfläche (TPSA) und die Wasserlöslichkeit wurden als nützliche Deskriptoren der Bioverfügbarkeit vorhergesagt55. Die untersuchten Verbindungen verzeichneten arzneimittelähnliches TPSA (150 < A2)56,57, akzeptable Löslichkeitsanforderung, wobei 7 g an der Spitze der Liste standen.

Zur Vorhersage der ADMET-Parameter für die aktuellen Studientreffer wurden Online-Server vor ADMET58 und ProTox-II59 eingesetzt. Die drei Verbindungen verzeichneten eine hohe vorhergesagte Darmabsorption (> 92,6 %), mittlere Caco-2-Modelle (PCaco2 = 25,18–32,72 nm/s) und niedrige MDCK-Modellpermeabilitäten (PMDCK = 0,07–6,74 nm/s) sowie eine starke Plasmaproteinbindung (90,83). –92,69 %) und mittlere ZNS-Absorption (BBB = 0,10–1,89). Es wurde vorhergesagt, dass die Verbindungen keine CYP2D6-Hemmung aufweisen und gemäß dem Globally Harmonised System for Classification and Labeling of Classified Chemicals (GHS) als Chemikalien der Klasse IV eingestuft wurden, mit einer hohen vorhergesagten mittleren tödlichen oralen Dosis (LD50 = 530–1739 mg/kg). ) bei Nagetieren. Eine zusätzliche Bewertung der vorhergesagten Toxizität ergab, dass von den drei untersuchten Verbindungen nicht erwartet wurde, dass sie hepatotoxisch, krebserregend oder mutagen sind, sodass davon ausgegangen werden konnte, dass es sich bei ihnen um sichere medikamentöse Leitstrukturen handelt.

Die Referenzwerte wurden wie zuvor für TPSA56,57, HIA60, PPB58, BBB61, Caco262,63, MDCK64, LD5059, Lipinski-Regel51, Veber-Regel52 und Egan-Regel53 angegeben berücksichtigt.

Die beobachtete Aktivität zeigte, dass das derzeit modifizierte Passerini-Gerüst im Allgemeinen die intrinsische Wirksamkeit der Leitstrukturen beibehält (Abb. 1) und gleichzeitig die Tumorzellselektivität erhöht. Allerdings hingen sowohl die Wirksamkeit als auch die Selektivität von der Art und Größe des Acyloxy-Gegenstücks ab. Der bioinspirierte 2-(1H-indol-3-yl)acetatester (7a) verlieh dem Hauptgerüst eine hervorragende Wirksamkeit und Selektivität gegen untersuchte Krebszelllinien. Der Ersatz des 2-(1H-Indol-3-yl)acetat-Motivs durch Chinolin-2-carboxylat (7b) verringerte die Wirksamkeit und Selektivität des Moleküls um fast das Zweifache. Der Ansatz zur Strukturvereinfachung des Acyloxy-Gegenstücks von (7a) zu Benzoat (7c) schwächte die antiproliferative Wirksamkeit gegenüber Caco-2-Zellen um das Dreifache und gegenüber HepG-2-Zellen um das 1,5-fache ab. Dies spiegelte sich in einer verringerten Selektivität für Caco-2 (5-fach) und HepG-2 (2-fach) wider. Eine weitere Substitution der Benzoatgruppe durch o-Chlor (7e) oder o-Iod (7f) führte zu einer Steigerung der Wirksamkeit (2-fach) und Selektivität (6-fach) gegen Caco-2-Zellen und einer zusätzlichen Steigerung der Aktivität gegen HepG-2 mit 2–3-fach höhere Selektivität im Vergleich zum unsubstituierten Derivat (7c). Das Verschieben des Chlorsubstituenten in (7e) in die para-Position (7d) begünstigte weder die Wirksamkeit noch die Selektivität gegenüber den untersuchten Zelllinien. Die Wirksamkeits- und Selektivitätsprofile des Gerüsts wurden durch Modifizierung der Benzoatgruppe zu Phenylacetat (7 g) oder Phenoxycarbonylphenylalaninat (7j) optimiert, was bei der bewerteten Serie die höchste aufgezeichnete Wirksamkeit und Selektivität ergab. Andere vielseitige Substituenten, nämlich Trifluormethylcinnamat (7h), 4-(Boc)aminobenzoylglycinat (7i) oder Thioglycolat (7k), zeigten relativ moderate Aktivitäten, die dem Benzoatderivat (7c) gegenüber Caco-2 überlegen und mit diesem gegenüber HepG-2 vergleichbar waren. Wichtig ist, dass die erfolgreichen antiproliferativen Derivate ein ähnliches Caspase-3/7-Aktivierungspotentialmuster aufwiesen, was die Möglichkeit unterstreicht, dass die Caspase-3/7-vermittelte apoptotische Induktion ihr wichtigster antiproliferativer Mechanismus sein könnte.

Diese Arbeit beschreibt die Strukturoptimierung eines vielversprechenden, von Passerini abgeleiteten Caspase-Aktivator-Gerüsts im Hinblick auf eine verbesserte Tumorselektivität durch den Ausschluss eines möglichen Toxikophors, die Einführung bioinspirierter Substituenten und Designansätze zur Strukturvereinfachung. Das erste Screening ergab eine hervorragende Selektivität gegenüber kolorektalen Caco-2- und hepatozellulären HepG-2-Krebszellen im Vergleich zu normalen Krebszellen (SI bis zu 266,8). Alle Derivate waren 5-Fluorouracil mit submikromolaren IC50-Werten überlegen. 7a, 7g und 7j waren die Studienhits. Die drei Derivate aktivierten Caspase bis zum 4,2-fachen in den behandelten Krebszellen, regulierten Bcl2 herunter und induzierten Apoptose (bis zu 58,7 %). Computerstudien sagten ihre akzeptablen Effizienzkennzahlen und arzneimittelähnlichen pharmakokinetischen Parameter voraus.

Die Materialien und Ausrüstung wurden in den Begleitinformationen beschrieben.

Eine Lösung von 4-Aminobenzoesäure 1 (20 g, 0,14 mol) in wasserfreiem EtOH (150 ml) und Schwefelsäure (17 ml) wurde erhitzt, bis die Säure vollständig verbraucht war (typischerweise 1–2 Stunden). Nach dem Abkühlen wurde die Mischung mit einer Waschsodalösung neutralisiert. Das gebildete gewünschte Produkt wurde filtriert und mit destilliertem Wasser gewaschen, um einen weißen Feststoff von 2 (22 g, 92 %) zu ergeben; Schmp. = 74–76 °C.

Zu einer Lösung von Ethyl-4-aminobenzoat 2 (11 g, 0,06 mol) in Toluol (100 ml) wurde Ameisensäure (3,98 g, 0,08 mol) tropfenweise zugegeben und anschließend 2 Stunden lang auf 85–90 °C erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Produkt gebildet, filtriert und mit destilliertem Wasser gewaschen, um einen weißen Feststoff von 3 (10,2 g, 79 %) zu ergeben; Schmp. = 138–140 °C.

Zu einer Mischung aus Formamid 3 (5,0 g, 0,026 Mol), I2 (9,87 g, 0,039 Mol) und Ph3P (10 g, 0,038 Mol) in DCM (75 ml) wurde Et3N (7,79 g, 10,7 ml, 0,07 Mol) gegeben tropfenweise hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde durch Zugabe von CHCl3 (50 ml) verdünnt und dann mit einer eiskalten gesättigten Na2S2O3-Lösung gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit DCM extrahiert und die organische Phase mit Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Na2SO4 getrocknet und filtriert. Die vereinigte organische Phase wurde eingedampft und mittels Säulenchromatographie (1:2, EtOAc-n-Hexan) gereinigt, um den entsprechenden braunen Feststoff von Isocyanid 4 (2 g, 55 %) zu ergeben; Schmp. = 93–96 °C, lit.36 101–105 °C.

Eine Mischung aus Ethyl-4-isocyanobenzoat 4 (50 mg, 0,286 mmol, 0,5 Äq.), Carbonsäurederivaten, nämlich Indol-3-essigsäure, Chinaldinsäure, Benzoesäure, 4-Chlorbenzoesäure, 2-Chlorbenzoesäure, 2-Iodbenzoesäure Säure, Phenylessigsäure, (E)-3-(4-(trifluormethyl)zimtsäure, N-Boc-4-aminohippursäure, (Phenoxycarbonyl)-l-phenylalanin bzw. 2-Mercaptoessigsäure 5a–k (0,57 mmol). , 1 Äquiv.) und überschüssiges Cyclohexanon 6 (2,86 mmol, 5 Äquiv.) wurden 24 Stunden bei RT gerührt und durch DC überwacht. Dann wurde die Reaktion mit 5 ml DCM verdünnt und mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung neutralisiert. Die organische Schicht wurde gesammelt, mit wasserfreiem Na2SO4 getrocknet und mittels Flash-Säulenchromatographie (1:3, EtOAc-n-Hexan) gereinigt.

Orangenpulver; Ausbeute 50 %; Schmp. = 79–81 °C; Rf 0,25 (1:2, EtOAc–n-Hexan); IR: vmax/cm−1 3372 (OCNH), 1697 (br, OC, NCO); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH: 10,94 (s, 1H, NH-CH), 9,88 (s, 1H, OC-NH), 7,88 (d, J = 9,0 Hz, 2H, Ar–H) , 7,77 (d, J = 9,0 Hz, 2H, Ar–H), 7,50 (d, J = 8,0 Hz, 1H, Ar–H), 7,33 (d, J = 8,5 Hz, 1H, Ar–H), 7,25 (d, J = 2,0 Hz, 1H, Ar–H), 7,04 (t, J = 7,5 Hz, 1H, Ar–H), 6,91 (t, J = 7,0 Hz, 1H, Ar–H), 4,27 (q , J = 7,5 Hz, 2H, OCH2–CH3), 3,87 (s, 2H, OC–CH2), 2,13 (d, J = 13,5 Hz, 2H, c-Hex-H), 1,77–1,71 (td, J = 14,5, 4,0 Hz, 2H, c-Hex-H), 1,59–1,50 (m, 3H, c-Hex-H), 1,41–1,34 (m, 2H, c-Hex-H), 1,30 (t, J = 7,5 Hz, 3H, OCH2–CH3), 1,25–1,20 (m, 1H, c-Hex-H); 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC: 171,6 (OCNH), 170,6 (C–O–CO), 165,4 (EtO–CO), 143,4, 136,1, 129,9, 127,1, 124,3, 124,2, 121,1, 119,4, 118,5, 118,4, 111,4, 106,9 (Ar–C), 81,2 (O–C–CO), 60,5 (OCH2), 31,3, 31,0, 24,6, 20,8 (c-Hex-C), 14,3 (CH3). Anal. berechnet. für C26H28N2O5 (448,51): C, 69,63; H, 6,29; N, 6,25; gefunden C: 69,42; H, 6,18; N, 6,43.

Orangenpulver; Ausbeute 56 %; Schmp. = 103–105 °C; Rf 0,32 (1:2, EtOAc–n-Hexan); IR: vmax/cm–1 3398 (OCNH), 1717, 1680 (OC, NCO); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH: 10,07 (s, 1H, –NH), 8,58 (d, J = 9,0 Hz, 1H, Ar–H), 8,17 (d, J = 8,5 Hz, 1H, Ar–H), 8,13 (d, J = 8,5 Hz, 1H, Ar–H), 8,08 (d, J = 8,0 Hz, 1H, Ar–H), 7,87–7,83 (m, 3H, Ar–H), 7,76–7,71 (m, 3H, Ar–H), 4,23 (q, J = 6,5 Hz, 2H, OCH2–CH3), 2,33 (d, J = 14,0 Hz, 2H, c-Hex-H), 2,04 (s , 1H, c-Hex-H), 1,95–1,89 (m, 2H, c-Hex-H), 1,66 (s, 5H, c-Hex-H), 1,25 (t, J = 7,5 Hz, 3H, OCH2 –CH3); 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC: 171,1 (OCNH), 165,4 (EtO–CO), 163,2 (C–O–CO), 147,8, 146,9, 143,4, 137,8, 130,8, 129,9, 129,0, 128,9, 128,1, 124,4, 121,2, 119,6 (Ar–C), 82,7 (O–C–CO), 60,5 (OCH2), 31,5, 30,7, 24,6, 21,1 (c-Hex-C), 14,2 (CH3). Anal. berechnet. für C26H26N2O5 (446,50): C, 69,94; H, 5,87; N, 6,27; gefunden C, 70,01; H, 5,97; N, 6,32.

Cremefarbenes Pulver; Ausbeute 55 %; Schmp. = 140 – 142 °C; Rf 0,48 (1:2, EtOAc–n-Hexan); IR: vmax/cm−1 3342 (OCNH), 1718, 1679 (OC, NCO); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH: 9,96 (s, 1H, -NH), 8,04 (d, J = 7,5 Hz, 2H, Ar–H), 7,87 (d, J = 9,0 Hz, 2H, Ar–H), 7,76 (d, J = 9,0 Hz, 2H, Ar–H), 7,69 (t, J = 7,0 Hz, 1H, Ar–H), 7,56 (t, J = 7,5 Hz, 2H, Ar– H), 4,26 (q, J = 7,0 Hz, 2H, OCH2–CH3), 2,31 (d, J = 13,5 Hz, 2H, c-Hex-H), 1,88 (td, J = 14,0, 2,5 Hz, 2H, c-Hex-H), 1,67 (d, J = 10,5 Hz, 3H, c-Hex-H), 1,60–1,51 (m, 2H, c-Hex-H), 1,33–1,31 (m, 1H, c- Hex-H), 1,28 (t, J = 7,5 Hz, 3H, OCH2–CH3); 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC: 171,3 (OCNH), 165,4 (EtO–CO), 164,4 (C–O–CO), 143,4, 133,6, 129,9, 129,6, 128,8, 124,4, 119,6 (Ar– C), 81,7 (O–C–CO), 60,5 (OCH2), 31,4, 24,6, 21,1 (c-Hex-C), 14,2 (CH3). Anal. berechnet. für C23H25NO5 (395,45): C, 69,86; H, 6,37; N, 3,54; gefunden C: 69,93; H, 6,42; N, 3,61.

Graues Pulver; Ausbeute 56 %; Schmp. = 193–195 °C; Rf 0,54 (1:2, EtOAc–n-Hexan); IR: vmax/cm–1 3277 (OCNH), 1717, 1684 (OC, NCO); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH: 9,92 (s, 1H, –NH), 8,00 (d, J = 9,0 Hz, 2H, Ar–H), 7,84 (d, J = 8,5 Hz, 2H, Ar–H), 7,71 (d, J = 8,5 Hz, 2H, Ar–H), 7,60 (d, J = 8,5 Hz, 2H, Ar–H), 4,23 (q, J = 7,5 Hz, 2H, OCH2– CH3), 2,26 (d, J = 13,5 Hz, 2H, c-Hex-H), 1,85 (td, J = 13,5, 2,5 Hz, 2H, c-Hex-H), 1,63 (d, J = 9,5 Hz, 3H, c-Hex-H), 1,55–1,48 (m, 2H, c-Hex-H), 1,32–1,28 (m, 1H, c-Hex-H), 1,25 (t, J = 7,0 Hz, 3H, OCH2–CH3); 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC: 171,1 (OCNH), 165,3 (EtO–CO), 163,6 (C–O–CO), 143,3, 138,5, 131,4, 130,0, 129,0, 128,7, 124,4, 119,6 ( Ar–C), 82,1 (O–C–CO), 60,5 (OCH2), 31,4, 30,7, 24,5, 21,1 (c-Hex-C), 14,2 (CH3). Anal. berechnet. für C23H24ClNO5 (429,89): C, 64,26; H, 5,63; N, 3,26; gefunden C, 64,19; H, 5,53; N, 3,39.

Weißes Puder; Ausbeute 51 %; Schmp. = 130–132 °C; Rf 0,42 (1:2, EtOAc–n-Hexan); IR: vmax/cm−1 3341 (OCNH), 1729, 1692 (OC, NCO); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH: 10,02 (s, 1H, −NH), 7,94–7,92 (m, 1H, Ar–H), 7,89 (d, J = 8,5 Hz, 2H, Ar–H ), 7,78 (d, J = 9,0 Hz, 2H, Ar–H), 7,63–7,59 (m, 2H, Ar–H), 7,53–7,50 (m, 1H, Ar–H), 4,27 (q, J = 14,0, 7,0 Hz, 2H, OCH2–CH3), 2,31 (d, J = 13,5 Hz, 2H, c-Hex-H), 1,94–1,90 (td, J = 13,5, 3,0 Hz, 2H, c-Hex-H ), 1,68–1,61 (m, 5H, c-Hex-H), 1,34–1,32 (m, 1H, c-Hex-H), 1,29 (t, J = 7,0 Hz, 3H, OCH2–CH3); 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC: 170,9 (OCNH), 165,4 (EtO–CO), 163,8 (C–O–CO), 143,4, 133,5, 132,0, 131,4, 130,9, 130,2, 130,0, 127,5, 124,5, 119,6 (Ar–C), 83,1 (O–C–CO), 60,5 (OCH2), 31,3, 24,5, 21,1 (c-Hex-C), 14,3 (CH3). Anal. berechnet. für C23H24ClNO5 (429,89): C, 64,26; H, 5,63; N, 3,26; gefunden C: 64,33; H, 5,71; N, 3,42.

Cremefarbenes Pulver; Ausbeute 76 %; Schmp. = 148–150 °C; Rf 0,45 (1:2, EtOAc–n-Hexan); IR: vmax/cm−1 3328 (OCNH), 1730, 1693 (OC, NCO); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH: 10,00 (s, 1H, –NH), 8,02 (d, J = 7,0 Hz, 1H, Ar–H), 7,93 (dd, J = 7,5, 2,0 Hz, 1H, Ar–H), 7,88 (d, J = 8,5 Hz, 2H, Ar–H), 7,79 (d, J = 9,0 Hz, 2H, Ar–H), 7,57 (t, J = 6,5 Hz, 1H, Ar–H), 7,30 (td, J = 8,0, 1,5 Hz, 1H, Ar–H), 4,26 (q, J = 7,5 Hz, 2H, OCH2–CH3), 2,31 (d, J = 14,0 Hz, 2H, c-Hex-H), 1,91 (td, J = 13,5, 3,0 Hz, 2H, c-Hex-H), 1,68–1,61 (m, 5H, c-Hex-H), 1,38–1,32 (m, 1H, c-Hex-H), 1,29 (t, J = 7,5 Hz, 3H, OCH2–CH3); 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC: 170,9 (OCNH), 165,4 (EtO–CO), 165,2 (C–O–CO), 143,4, 140,9, 135,4, 133,3, 130,8, 130,0, 128,3, 124,4, 119,7 (Ar–C), 94,7 (CI), 82,9 (O–C–CO), 60,5 (OCH2), 31,3, 24,5, 21,1 (c-Hex-C), 14,3 (CH3). Anal. berechnet. für C23H24INO5 (521,34): C, 52,99; H, 4,64; N, 2,69; gefunden C, 53,11; H, 4,88; N, 2,91.

Cremefarbenes Pulver; Ausbeute 72 %; Schmp. = 90 – 93 °C; Rf 0,48 (1:2, EtOAc–n-Hexan); IR: vmax/cm−1 3386 (OCNH), 1737, 1708, 1681 (OC, NCO); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH: 9,87 (s, 1H, –NH), 7,89 (d, J = 9,0 Hz, 2H, Ar–H), 7,77 (d, J = 9,0 Hz, 2H, Ar–H), 7,33–7,28 (m, 4H, Ar–H), 7,26–7,23 (m, 1H, Ar–H), 4,27 (q, J = 7,0 Hz, 2H, OCH2–CH3), 3,78 (s , 2H, CO–CH2–Ar), 2,12 (d, J = 13,5 Hz, 2H, c-Hex-H), 1,74 (td, J = 14,0, 3,5 Hz, 2H, c-Hex-H), 1,53– 1,50 (m, 3H, c-Hex-H), 1,35–1,32 (m, 2H, c-Hex-H), 1,29 (t, J = 7,5 Hz, 3H, OCH2–CH3), 1,24–1,19 (m, 1H, c-Hex-H); 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC: 171,3 (OCNH), 170,1 (C–O–CO), 165,4 (EtO–CO), 143,3, 134,3, 129,9, 129,5, 128,4, 128,3, 126,9, 124,4, 119,5 (Ar–C), 81,4 (O–C–CO), 60,5 (OCH2), 40,9 (CO–CH2), 31,3, 24,5, 20,7 (c-Hex-C), 14,2 (CH3). Anal. berechnet. für C24H27NO5 (409,47): C, 70,40; H, 6,65; N, 3,42; gefunden C: 70,66; H, 6,81; N, 3,70.

Orangefarbener Kristall; Ausbeute 57 %; Schmp. = 145–147 °C; Rf 0,80 (1:2, EtOAc–n-Hexan); IR: vmax/cm–1 3343 (OCNH), 1715, 1639 (OC, NCO); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH: 9,93 (s, 1H, –NH), 7,95 (d, J = 8,0 Hz, 2H, Ar–H), 7,84 (d, J = 9,0 Hz, 2H, Ar–H), 7,76–7,73 (m, 4H, Ar–H), 7,71 (s, 1H, Ar–CH=CH), 6,86 (d, J = 16,0 Hz, 1H, Ar–CH=CH), 4,23 (q, J = 7,0 Hz, 2H, OCH2–CH3), 2,20 (d, J = 14,0 Hz, 2H, c-Hex-H), 1,81 (td, J = 16,0 ,4,0 Hz, 2H, c-Hex- H), 1,62–1,45 (m, 6H, c-Hex-H), 1,26 (t, J = 7,5 Hz, 3H, OCH2–CH3); 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC: 171,8 (OCNH), 165,9 (EtO–CO), 165,1 (C–O–CO), 143,9 (CH=CH–Ar), 143,6, 138,5, 130,4, 129,6 , 126,3, 124,8 (CF3), 121,7 (Ar–C), 120,0 (CH=CH–Ar), 82,0 (O–C–CO), 61,0 (OCH2), 31,9, 25,1, 21,5 (c-Hex-C) , 14,7 (CH3). Anal. berechnet. für C26H26F3NO5 (489,48): C, 63,80; H, 5,35; N, 2,86; gefunden C: 63,99; H, 5,52; N, 3.08.

Rotbraunes Pulver; Ausbeute 62 %; Schmp. = 115–117 °C; Rf 0,26 (1:2, EtOAc–n-Hexan); IR: vmax/cm−1 3334 (br, NH's), 1713, 1644 (OC, NCO); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH: 9,74, 9,62 (2 s, 2H, 2NH), 8,90 (t, J = 5,5 Hz, 1H, CH2–NH), 7,88–7,71 (m, 6H, Ar –H), 7,48 (d, J = 9,0 Hz, 2H, Ar–H), 4,26–4,22 (m, 3H, CH2–NH, OCH2–CH3), 4,08 (d, J = 5,5 Hz, 1H, CH2– NH), 2,11 (d, J = 12,5 Hz, 2H, c-Hex-H), 2,04 (s, 2H, c-Hex-H), 1,75 (td, J = 14,5, 4,5 Hz, 2H, c-Hex -H), 1,55 (bs, 4H, c-Hex-H), 1,44 (s, 9H, C(CH3)3), 1,26 (t, J = 7,0 Hz, 3H, OCH2–CH3). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC: 171,2 (OCNH), 169,0 (EtO–CO), 166,7 (CH2–NH–CO), 165,4 (C–O–CO), 152,6 (NH–CO–O ), 143,4, 143,2, 142,7, 130,0, 129,9, 128,2, 126,7, 124,4, 119,5, 117,2 (Ar–C), 81,9 (O–C–CO), 79,6 (C(CH3)3), 60,5 (OCH2), 41,8 (CH2-NH), 31,5, 30,7, 28,1 (C(CH3)3), 20,7 (c-Hex-C), 14,2 (CH3). Anal. berechnet. für C30H37N3O8 (567,63): C, 63,48; H, 6,57; N, 7,40; gefunden C: 63,66; H, 6,77; N, 7,88.

Rotbrauner Kristall; Ausbeute 71 %; Schmp. = 103–105 °C; Rf 0,48 (1:2, EtOAc–n-Hexan); IR: vmax/cm−1 3336 (br, NH's), 1709 (br, OC, NCO); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH: 9,53 (s, 1H, –NH), 7,90 (d, J = 8,0 Hz, 1H, –NH), 7,86 (d, J = 8,5 Hz, 2H, Ar –H), 7,73 (d, J = 9,0 Hz, 2H, Ar–H), 7,28–7,17 (m, 10H, Ar–H), 4,95 (q, J = 12,5 Hz, 2H, Ar–CH2), 4,44 –4,39 (m, 1H, CH), 4,24 (q, J = 7,0 Hz, 2H, OCH2–CH3), 3,15 (dd, J = 14,5, 5,0 Hz, 1H, c-Hex-H), 2,86 (dd, J = 13,5, 4,0 Hz, 1H, c-Hex-H), 2,08 (d, J = 11,0 Hz, 2H, c-Hex-H), 1,75–1,70 (m, 2H, c-Hex-H), 1,51 (d, J = 8,5 Hz, 3H, c-Hex-H), 1,43–1,34 (m, 1H, c-Hex-H), 1,26 (t, J = 7,5 Hz, 3H, OCH2–CH3); 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC: 171,0 (O–CO–CH), 170,6 (NH–CO–C), 165,4 (EtO–CO), 156,4 (NH–O–O), 143,1, 137,5 , 136,8, 130,0, 129,1, 128,3, 128,2, 127,9, 127,6, 126,5, 124,5, 119,4 (Ar–C), 82,1 (O–C–CO), 65,6 (OCH2), 60,5 (CH–CH2), 55,6 (CH –CH2), 36,0, 31,4, 31,1, 24,5, 20,7 (c-Hex-C), 14,2 (CH3). Anal. berechnet. für C32H34N2O7 (558,62): C, 68,80; H, 6,13; N, 5,01; gefunden C, 69,11; H, 6,40; N, 5,33.

Gelber Kristall; Ausbeute 50 %; Schmp. = 108–110 °C; Rf 0,35 (1:2, EtOAc–n-Hexan); IR: vmax/cm−1 3318 (OCNH), 2570 (SH), 1741, 1705, 1679 (OC, NCO); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH: 9,84 (s, 1H, –NH), 7,87 (d, J = 8,5 Hz, 2H, Ar–H), 7,75 (d, J = 8,0 Hz, 2H, Ar–H), 4,26 (q, J = 7,0 Hz, 2H, OCH2–CH3), 4,03–3,80 (m, 2H, CH2-SH), 2,15 (d, J = 12,5 Hz, 2H, c-Hex-H ), 1,79 (t, J = 12,0 Hz, 2H, c-Hex-H), 1,60–1,38 (m, 5H, c-Hex-H), 1,29 (t, J = 7,0 Hz, 3H, OCH2–CH3) , 1,25–1,21 (m, 1H, c-Hex-H), 0,85–0,80 (m, 1H, –SH). 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC: 171,0 (OCNH), 168,1 (EtO–CO), 165,3 (O–CO–CH2), 143,2, 129,9, 124,5, 119,6, 118,6 (Ar–C), 82,4 (O–C–CO), 60,5 (OCH2), 40,7 (CH2-SH), 31,3, 24,5, 20,8 (c-Hex-C), 14,2 (CH3). Anal. berechnet. für C18H23NO5S (365,44): C, 59,16; H, 6,34; N, 3,83; gefunden C, 59,31; H, 6,51; N, 3,97.

Rotbrauner Kristall; Ausbeute 50 %; Schmp. = 160–163 °C; Rf 0,32 (1:2, EtOAc–n-Hexan); IR: vmax/cm−1 3326 (OH), 3264 (OCNH), 1718, 1656 (OC, NCO); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH: 9,91 (s, 1H, –NH), 7,85 (q, J = 12,0, 8,5 Hz, 4H, Ar–H), 5,49 (s, 1H, OH), 4,23 (q, J = 6,5 Hz, 2H, OCH2–CH3), 1,70 (td, J = 13,0, 4,0 Hz, 2H, c-Hex-H), 1,56 (d, J = 12,0 Hz, 5H, c-Hex -H), 1,52–1,47 (m, 2H, c-Hex-H), 1,26 (t, J = 7,0 Hz, 3H, OCH2–CH3), 1,19–1,14 (m, 1H, c-Hex-H); 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC: 177,1 (OCNH), 165,9 (EtO–CO), 143,7, 130,5, 124,8, 119,5 (Ar–C), 74,5 (O–C–CO), 60,9 (OCH2 ), 34,2, 31,2, 25,5, 21,3 (c-Hex-C), 14,7 (CH3). Anal. berechnet. für C16H21NO4 (291,34): C, 65,96; H, 7,27; N, 4,81; gefunden C, 66,12; H, 7,51; N, 4,90.

Orangefarbener Kristall; Ausbeute 60 %; Schmp. = 143–145 °C; Rf 0,77 (1:2, EtOAc–n-Hexan); IR: vmax/cm−1 1815 (CO–N–CO), 1736 (EtO–CO); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH: 8,06 (d, J = 9,0 Hz, 2H, Ar–H), 7,62 (d, J = 8,5 Hz, 2H, Ar–H), 4,30 (q, J = 7,0 Hz, 2H, OCH2–CH3), 2,04 (s, 2H, c-Hex-H), 1,80 (td, J = 12,0, 4,0 Hz, 2H, c-Hex-H), 1,72–1,68 (m, 2H, c-Hex-H), 1,62–1,48 (m, 4H, c-Hex-H), 1,29 (t, J = 7,5 Hz, 3H, OCH2–CH3); 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC: 174,0 (N–CO), 165,0 (EtO–CO), 152,8 (N–CO–O), 135,4, 129,8, 129,7, 126,6 (Ar–C), 85,0 (O–C–CO), 61,1 (OCH2), 31,2, 30,7, 23,8, 20,8 (c-Hex-C), 14,1 (CH3). Anal. berechnet. für C17H19NO5 (317,34): C, 64,34; H, 6,03; N, 4,41; gefunden C: 64,64; H, 6,32; N, 4,52.

Wi-38-, Caco-2- und HepG-2-Zellen wurden in DMEM-Medium mit 10 % FBS kultiviert, als 5 × 103 Zellen pro Vertiefung in einer Zellkulturplatte mit 96 Vertiefungen ausgesät und bei 37 °C in einem 5 % CO2-Inkubator inkubiert. Nach 24 Stunden wurden serielle Konzentrationen der Testverbindungen 72 Stunden lang mit Zellen inkubiert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde über das MTT-Protokoll27 (Ergänzungsdaten) getestet. Die IC50-Werte der synthetisierten Verbindungen wurden mit der Graphpad Instat-Software gemessen. Morphologische Veränderungen wurden unter Verwendung eines Phasenkontrast-Umkehrmikroskops mit einer Digitalkamera (Olympus, Japan) untersucht.

Das ApoONE® Caspase-3/7-Kit wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet (Ergänzende Daten).

Die Darmkrebszelllinie (Caco-2) wurde mit den wirksamsten Antikrebsverbindungen bei 0,06 µM 72 Stunden lang in einem 5 % CO2-Inkubator inkubiert. RNAs von unbehandelten und behandelten Krebszellen wurden mit dem Gene JET RNA-Reinigungskit (Thermo Scientific, USA) extrahiert. Anschließend wurden cDNAs mit dem cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, USA) synthetisiert. Die Echtzeit-PCR wurde mit dem SYBR-Green-Master-Mix und spezifischen Primern (Vorwärts/Rückwärts) durchgeführt, wie in den ergänzenden Daten beschrieben.

Die Trefferverbindungen wurden durch Inkubation von MDA-MB 231-Zellen für 72 Stunden bei ihren minimalen IC50-Dosen auf ihre proapoptotischen Wirkungen untersucht. Nach der Trypsinisierung wurden die behandelten und unbehandelten Krebszellen mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Annexin V/Propidiumiodid (PI) angefärbt und anschließend einer durchflusszytometrischen Analyse der Apoptose unterzogen, wie zuvor berichtet20 (Ergänzende Daten).

Die statistische Analyse wird in den Zusatzdaten beschrieben.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Chemieabteilung, Fakultät für Naturwissenschaften, Universität Alexandria, PO Box 426, Alexandria, 21321, Ägypten

Mohammed Salah Ayoup, Yasmin Wahby und Hamida Abdel-Hamid

Abteilung für medizinische Biotechnologie, Forschungsinstitut für Gentechnik und Biotechnologie, Stadt für wissenschaftliche Forschung und technologische Anwendungen (SRTA-Stadt), Borg El Arab, Ägypten

Marwa M. Abu-Serie

Abteilung für Pharmazeutische Chemie, Fakultät für Pharmazie, Universität Alexandria, Alexandria, 21521, Ägypten

Mohamed Teleb

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MSA-Idee und Betreuung der experimentellen Arbeiten. YW führte die experimentellen Arbeiten durch. HA-H. Aufsicht und sie überprüfte den Text. MMA übernahm den biologischen Teil. MT übernahm den biologischen Teil und verfasste das Manuskript.

Korrespondenz mit Mohammed Salah Ayoup.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ayoup, MS, Wahby, Y., Abdel-Hamid, H. et al. Strukturoptimierung neuer tumorselektiver Passerini-α-Acyloxycarboxamide als Caspase-3/7-Aktivatoren. Sci Rep 12, 22390 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26469-4

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Eingegangen: 13. September 2022

Angenommen: 15. Dezember 2022

Veröffentlicht: 27. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26469-4

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