NADH- und NADPH-Peroxidasen als antioxidative Abwehrmechanismen im Darmsulfat

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 13922 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Tierische und menschliche Fäkalien enthalten typischerweise intestinale sulfatreduzierende Bakterien (SRB). Schwefelwasserstoff und Acetat sind die Endprodukte ihrer dissimilatorischen Sulfatreduktion und können einen synergistischen Effekt erzeugen. Hier berichten wir über NADH- und NADPH-Peroxidaseaktivitäten aus intestinalem SRB Desulfomicrobium orale und Desulfovibrio piger. Wir wollten enzymatische Aktivitäten unter dem Einfluss verschiedener Temperatur- und pH-Regime vergleichen und kinetische Analysen der enzymatischen Reaktionsgeschwindigkeiten, maximalen Mengen des Reaktionsprodukts, Reaktionszeiten, maximalen Geschwindigkeiten der Enzymreaktionen und Michaelis-Konstanten durchführen Zellfreie Extrakte aus intestinalem SRB, D. piger Vib-7 und D. orale Rod-9, gesammelt aus exponentiellen und stationären Wachstumsphasen. Die optimale Temperatur (35 °C) und der optimale pH-Wert (7,0) für die Aktivität beider Enzyme wurden ermittelt. Der Unterschied in den Trends der Michaelis-Konstanten (Km) während der exponentiellen und stationären Phase ist zwischen D. piger Vib-7 und D. orale Rod-9 erkennbar; D. orale Rod-9 zeigte während der beiden überwachten Phasen einen viel höheren Km-Wert (Ausnahme: NADH-Peroxidase von D. piger Vib-7: 1,42 ± 0,11 mM). Untersuchungen der NADH- und NADPH-Peroxidasen – als mutmaßliche antioxidative Abwehrsysteme des intestinalen SRB und detaillierte Daten zu den kinetischen Eigenschaften dieses Enzyms, ausgedrückt durch die Zersetzung von Wasserstoffperoxid – könnten für die Aufklärung der evolutionären Mechanismen antioxidativer Abwehrsysteme und ihrer Ätiologie wichtig sein Rolle im Prozess der dissimilatorischen Sulfatreduktion und ihre mögliche Rolle bei der Entstehung von Darmerkrankungen.

Sulfatreduzierende Bakterien (SRB) entwickeln sich in Gegenwart von Laktat und Sulfat im menschlichen Darm schnell, was zur Bildung von Schwefelwasserstoff (H2S) führt, der toxisch und schädlich für epitheliale Darmzellen ist1,2,3,4,5 ,6,7,8. Allerdings ist H2S eine Schwefelquelle für methanogene Archaeen, die auch im Magen-Darm-Trakt in großer Zahl vorkommen. Darüber hinaus ist es möglich, dass die Überproduktion und Anreicherung von H2S schädlich ist und nicht sein bloßes Vorhandensein9, 10. Entzündliche Darmerkrankungen (IBDs) können sich bei Menschen und Tieren aufgrund einer Zunahme der Anzahl von SRB und der Intensität der Dissimilation entwickeln Sulfatreduktion im Darm2, 11,12,13,14,15,16.

Anorganisches Sulfat oder andere oxidierte Formen von Schwefel werden durch dissimilatorisches SRB in Sulfid umgewandelt17,18,19. Da diese Bakteriengemeinschaften heterotroph sind, benötigen sie eine Versorgung mit organischem Kohlenstoff. Einfache organische Verbindungen wie Laktat, Pyruvat und Malat können als Kohlenstoffquelle für die Arten Desulfovibrio und Desulfomicrobium dienen18, 20; Diese werden anschließend zu Acetat oxidiert und gleichzeitig Sulfat zu Sulfid reduziert1, 21, 22. Durch diesen mehrstufigen Oxidationsprozess für organische Moleküle erhalten Heterotrophe ihre zelluläre Energie23,24,25,26. SRB-Arten verwenden typischerweise Laktat als Substrat, das sie dann gleichzeitig mit Pyruvat zu Acetat oxidieren24.

Endogene antioxidative Enzyme können bei der Entfernung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) wirken. Zu den bekannten antioxidativen Enzymen, die die intrazelluläre ROS-Produktion und Lipidperoxidation verhindern, gehören Superoxiddismutase (SOD), Katalase und Peroxidasen27. Während Katalase Wasserstoffperoxid (H2O2) durch Dismutation in Wasser und molekularen Sauerstoff (O2) abbaut, wandelt SOD Superoxidradikale in Wasserstoffperoxid (H2O2)28 um.

Peroxidasen (EC 1.11.1.7) sind Häm-haltige Enzyme, die H2O2 verwenden, um die Oxidation einer Reihe von Substraten zu katalysieren29.

Ein nicht-radikales ROS-Nebenprodukt des typischen aeroben Stoffwechsels ist H2O2. Die hohen Mengen an H2O2 könnten jedoch in andere, reaktivere ROS, wie Hydroxylradikale, umgewandelt werden, die Biomoleküle oxidieren und Alterung, Zelltod, Gewebeschäden, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und bösartige Veränderungen verursachen können. Daher ist die H2O2-Fängeraktivität eine entscheidende Komponente aller antioxidativen Aktivitäten in einem biologischen System30. In H2O2 und anderen Wasserstoffakzeptoren ist Peroxidase im Vergleich zu anderen Elektronenakzeptoren aktiver. Ascorbat, eine Reihe von Aminosäuren und polyphenolische Substanzen sind Wasserstoffspender für SRB31:

NADH-Peroxidase (EC 1.11.1.1) ist für die enzymatische Katalyse der folgenden chemischen Reaktion verantwortlich32,33,34,35:

Die Funktion der NADH-Peroxidase besteht darin, H2O2 zu inaktivieren, das in der Zelle durch Glycerin-3-Phosphat-Oxidase während des Metabolismus von Glycerin und der Dismutation von Superoxid erzeugt wird, bevor das H2O2 wesentliche Zellkomponenten schädigen kann. NADH eliminiert potenziell toxisches H2O2 unter aeroben Wachstumsbedingungen und dieser Prozess stellt eine enzymatische Abwehr gegen H2O2-vermittelten oxidativen Stress dar. Das Enzym kann auch vor exogenem H2O2 schützen und auf diese Weise zur bakteriellen Virulenz beitragen32,33,34,36. Eine NADPH-Peroxidase (EC 1.11.1.2) ist ein Enzym, das H2O2 durch die gleiche chemische Reaktion wie NADH-Peroxidase katalysiert, aber anstelle von NAD+ wird NADP+ gebildet37.

NADH- und NADPH-Peroxidasen wurden in sulfatreduzierenden Desulfovibrio-Bakterien ohne Katalaseaktivität beschrieben (außer D. desulfuricans ATCC 27774)38. Aktive NADH- und NADPH-Peroxidasen katalysieren die Spaltung von H2O2 in den D. desulfuricans-Zellen. Diese Enzyme wurden sowohl in den membranhaltigen Fraktionen des Periplasmas als auch des Zytoplasmas gefunden. NADPH-Peroxidase ist hauptsächlich im Periplasma lokalisiert (70 %), wohingegen NADH-Peroxidase nahezu gleichmäßig im Periplasma und in den membranhaltigen Fraktionen des Zytoplasmas verteilt ist (60 bzw. 40 %)38. Die Aktivität der Peroxidase hängt nicht vom physiologischen Zustand der Kultur ab. Andererseits ist die NADH-Peroxidase-Aktivität der Zellen in der stationären Wachstumsphase höher als die Enzymaktivität in Zellen während der exponentiellen Wachstumsphase38. Es sollte betont werden, dass Peroxidasen aus intestinalem SRB D. piger und D. orale nie gut charakterisiert wurden. In der derzeit verfügbaren Literatur gibt es einige Daten zu Peroxidasen in verschiedenen Organismen sowie in aus der Umwelt isolierten SRB27,28,30,38. Informationen zur Aktivität und Kinetik dieses Enzyms aus intestinalem SRB D. piger und D. orale liegen jedoch noch nicht vor.

Die Ziele der aktuellen Studie bestanden darin, die Peroxidaseaktivität in zellfreien Extrakten der intestinalen sulfatreduzierenden Bakterien D. piger Vib-7 und D. orale Rod-9 als wichtige Enzyme des Antioxidationssystems zu bestimmen und kinetische Bewertungen ihrer enzymatischen Aktivitäten durchzuführen .

Die sulfatreduzierenden Bakterien Desulfovibrio piger Vib-7 (GenBank: KT881309.1) und Desulfomicrobium orale Rod-9 (GenBank: MF939896), die aus Kot des Dickdarms eines gesunden Menschen isoliert und mithilfe der Sequenzanalyse der 16S-rRNA identifiziert wurden Gen, standen im Mittelpunkt dieser Studie20, 39.

In einem modifizierten flüssigen anoxischen Medium C von Postgate wurden beide Bakterien gezüchtet20, 39,40,41. Um ein O2-freies Medium zu erzeugen, wurde das Medium 30 Minuten lang in Wasser gekocht, bevor es auf 30 °C abgekühlt wurde. Na2S (1 %) in 1 % NaHCO3 wurde als Reduktionsmittel vor der Aussaat der Bakterien im Medium eingesetzt (E0 des Mediums betrug –200 mV). Das Potenzial wurde mit einem pH-Meter gemessen: Greisinger G1500. Eine sterile 10 N NaOH-Lösung wurde verwendet, um den endgültigen pH-Wert des Mediums auf 7,5 zu senken. Das Verhältnis des Impfvolumens zum Mediumvolumen betrug 5 %. Die Bakterien wurden 72 Stunden lang bei 37 °C41 in Kolben anaerob kultiviert. Darüber hinaus wurden dem Medium reduziertes FeS und Na2S zugesetzt, was die notwendigen Redoxbedingungen für SRB-Kulturen bereitstellte. Die Biomasse von Bakterienkulturen wurde photometrisch bestimmt, gemäß der zuvor in der veröffentlichten Arbeit39 beschriebenen Methode: Etwa 1 ml flüssiges Medium ohne Mohr-Salz wurde in eine Plastikküvette überführt und zum Tarieren in ein Biophotometer (Eppendorf BioPhotometerD30) gebracht. Anschließend wurde 1 ml Bakteriensuspension in eine andere Küvette überführt und erneut dem Biophotometer zugeführt. Bevor SRB für die Experimente verwendet wurden, wurde immer die optische Dichte (OD340) gemessen. Die optische Dichte des Inokulats wurde gemessen und auf die gleiche Menge an Zellen normalisiert, die das gesamte Bakterienwachstum inokulierten.

Nach 18 Stunden exponentiellem Wachstum und 36 Stunden stationärem Wachstum wurden die Zellen geerntet, 30 Minuten lang bei 5000 × g und 4 °C zentrifugiert, mit 0,02 M Tris-HCl-Puffer gewaschen und dann im gleichen Puffer in einem Verhältnis von suspendiert 2–2,5 g Nassgewicht auf 10 ml derselben Lösung. Bakterienzellen wurden aufgebrochen und unter Verwendung des Ultraschalldesintegrators bei 22 kHz 1 Minute lang bei 0 °C homogenisiert und anschließend zentrifugiert (17.000 × g, 60 Minuten, 4 °C), um die Zelltrümmer zu entfernen und zellfreie Extrakte zu erhalten.

Die Geschwindigkeit der NADH- oder NADPH-Peroxidation wurde bei 340 nm (ɛ = 6220 M−1 cm−1) gemessen. Durch die Zugabe von 2 mM H2O2 wurde der Prozess gestartet. Die Testmischung enthielt zellfreie Extrakte, verdünnt in Tris-HCl-Puffer (50 mM, pH 7,6) (Endvolumen 1 ml). Wie bereits erwähnt38, wurden NADH und NADPH in Mengen von 50 bis 500 μM zugesetzt. Bei den Kontrollproben handelte es sich um die gleiche Mischung, jedoch ohne bakterienzellfreie Extrakte. Zur Berechnung des Proteingehalts in den zellfreien Extrakten wurde die Bradford-Methode verwendet42.

Bei der Reaktion von H2O2 und der Sonde entsteht ein Produkt, das proportional zur Menge der Peroxidaseaktivität ist. Diese Reaktion kann mithilfe kolorimetrischer (570 nm) und fluorometrischer (λex = 535/λem = 587 nm) Techniken (Sigma-Aldrich-Kit für) beobachtet werden Bestimmung der Peroxidase-Aktivität verwendet wurde). Die Menge an Peroxidase, die 1,0 mol H2O2 pro Minute bei 37 °C senkt, wird als eine Einheit bezeichnet (U = 1 μmol/min). Als U × mg−1 Protein wurde die spezifische Enzymaktivität ausgedrückt.

Die spezifische Enzymaktivität in zellfreien Extrakten beider Bakterienstämme wurde auch unter dem Einfluss zweier wichtiger Faktoren bestimmt: pH-Werte (4,0–10,0) und Temperaturbereiche (20, 25, 30, 35, 40 und 45 °C). Unter den verschiedenen Einstellungen (pH-Wert und Temperatur) blieb die Zusammensetzung derselben Kombination im Wesentlichen gleich. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von Säure (HCl) und Base (NaOH) eingestellt. Die Temperatur der Mischung wurde ebenfalls angepasst und unter verschiedenen Temperaturbedingungen kultiviert.

In einem Standard-Inkubationsmedium (siehe oben) mit angepassten physikalischen und chemischen Eigenschaften der relevanten Testparameter (dh Inkubationsdauer, Substratkonzentration, Temperatur und pH-Wert) wurde eine kinetische Untersuchung der Enzymreaktion durchgeführt. Die anfängliche (augenblickliche) Reaktionsgeschwindigkeit (V0), die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (Vmax), die maximale Menge des Reaktionsprodukts (Pmax) und die charakteristische Reaktionszeit (Zeit der halben Sättigung, τ) wurden als kinetische Parameter identifiziert, die das beschreiben H2O2-Reaktion.

Zur Bestimmung des Volumens des Reaktionsprodukts wurden stöchiometrische Berechnungen verwendet. Ein Lineweaver-Burk-Diagramm43 wurde verwendet, um die kinetischen Parameter zu ermitteln, die Peroxidaseprozesse definieren, einschließlich der Michaelis-Konstante (Km) und der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit des Substratabbaus. Unter normalen Testbedingungen wurden Anfangsgeschwindigkeiten mit verschiedenen Substratkonzentrationen ermittelt, um den substratkinetischen Mechanismus von Peroxidasen zu analysieren.

Um die kinetischen Daten für schnelle Gleichgewichtsgeschwindigkeitsgleichungen zu modellieren, wurden die erhaltenen Daten auch durch globale Kurvenanpassung in SigmaPlot (Systat Software, Inc., https://systatsoftware.com/products/sigmaplot/sigmaplot-how-to-cite-) untersucht. sigmaplot/, Palo Alto, CA 94303, USA) beschreibt geordnetes sequentielles V = (Vmax [A] [B])/(KA KB + KB [A] + [A] [B]) und zufälliges sequentielles V = ( Vmax [A] [B])/(α KA KB + KB [A] + KA [B] + [A] [B]) kinetische Mechanismen, wobei V die Anfangsgeschwindigkeit, Vmax die Maximalgeschwindigkeit, KA und KB ist sind die Km-Werte für die Substrate A bzw. B, und α ist der Wechselwirkungsfaktor, wenn die Bindung eines Substrats die Dissoziationskonstante für das andere ändert44.

Zur Berechnung der kinetischen und statistischen Eigenschaften der Daten wurden die Softwareprogramme MS Office und Origin (www.originlab.com) verwendet. Der Student-T-Test wurde verwendet, um die Forschungsergebnisse mithilfe von Methoden der Variationsstatistik zu analysieren. Zur Bestimmung der linearen Gleichung wurde die Methode der kleinsten Quadrate verwendet. Der absolute Wert des Korrelationskoeffizienten r lag zwischen 0,90 und 0,98. Die Signifikanz der berechneten Parameter der Linie wurde mit dem Fisher-F-Test getestet. Die Näherung wurde als genaue Näherung angesehen, wenn P ≤ 0,0545. Gesamtunterschiede zwischen Enzymaktivitäten und kinetischen Parametern von NADH- und NADPH-Peroxidasen wurden durch Hauptkomponentenanalyse (PCA) bestimmt. Der Eigenwert wurde für zwei Gruppen auf über Null geschätzt, was 99 % der Gesamtvarianz erklärt.

Die Autoren bestätigen, dass alle Methoden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt wurden. Die Autoren bestätigen, dass alle Versuchsprotokolle vom Komitee der Masaryk-Universität genehmigt wurden (Nr. EKV-2021-060). Die Autoren bestätigen, dass die Einwilligung aller Probanden und/oder ihrer Erziehungsberechtigten eingeholt wurde.

Der intestinale SRB D. piger Vib-7 erreichte die Wachstumsphase nach 36 Stunden in der stationären Phase, D. orale Rod-9 hatte jedoch das Maximum nach 60 Stunden. Die Probenentnahme erfolgte aus beiden Kulturen nach 24 Stunden (exponentielle Phase) und 60 Stunden (stationäre Phase) der Kultivierung (Abb. 1A). Die spezifische Peroxidaseaktivität – ein wichtiges Enzym im Prozess der antioxidativen Abwehr bei SRB – wurde im zellfreien Extrakt von D. piger Vib-7- und D. orale Rod-9-Zellen gemessen, der während der exponentiellen und stationären Phase entnommen wurde (Abb . 1B). Die höchste Aktivität der NADH-Peroxidase (79,25 und 48,55 U × mg−1 Protein) wurde bei Extrakten von D. piger Vib-7 und D. orale Rod-9 festgestellt, die während der stationären Phasen kultiviert wurden. Obwohl die Aktivität von D. orale Rod-9 zwischen der exponentiellen und stationären Phase leicht unterschiedlich war, war die Aktivität der NADPH-Peroxidasen in D. piger Vib-7 in der exponentiellen und stationären Phase ähnlich (p > 0,05).

Biomasseakkumulation von D. piger Vib-7 und D. orale Rod-9 (A) sowie NADH/NADPH-Peroxidaseaktivität (B) im zellfreien Extrakt von intestinalem SRB in Abhängigkeit von ihrer physiologischen Phase (Mittelwert ± SD, n = 5).

Die enzymatische Aktivität wird stark von Umwelt- und physikalischen Faktoren wie Temperatur und pH-Wert beeinflusst. In einigen Fällen können Temperatur und pH-Wert die Aktivität simulieren und gleichzeitig manchmal auch die Aktivität verschleiern. Die Aktivitäten der NADH- und NADPH-Peroxidasen in den intestinalen SRB-Gattungen Desulfovibrio und Desulfomicrobium wurden nie mit wissenschaftlicher Genauigkeit überwacht; Die Auswirkungen von Temperatur und pH-Wert der Reaktionsmischung auf die Peroxidaseaktivität in den zellfreien Extrakten des SRB wurden untersucht (Abb. 2).

Der Einfluss von Temperatur (A) und pH-Wert (B) auf die NADH- und NADPH-Peroxidaseaktivität (Mittelwert ± SD, n = 5) in den zellfreien Extrakten, die aus verschiedenen Bakterienwachstumsphasen (exponentiell und stationär) hergestellt wurden.

Die optimale Temperatur für enzymatische Reaktionen wurde für beide Bakterienarten der Gattungen Desulfovibrio und Desulfomicrobium sowie für beide Enzyme (NADH- und NADPH-Peroxidasen) bei 35 °C bestimmt. Die Erhöhung (maximal 45 °C) oder Verringerung (mindestens 20 °C) der optimalen Temperatur führte zu einem extremen Rückgang der enzymatischen Aktivität in Extrakten, die während exponentieller und stationärer Wachstumsphasen gesammelt wurden. Allerdings zeigten beide Enzyme bei niedrigeren Temperaturen (20–25 °C) während der stationären Phase beider getesteten Bakterienkulturen eine geringere Aktivität im Vergleich zu den Ergebnissen, die bei der optimalen Temperatur erzielt wurden (Abb. 2A). Die höchste enzymatische Aktivität der NADH- und NADPH-Peroxidasen für D. piger Vib-7 und D. orale Rod-9 wurde bei pH 6,5 bis 7,0 gemessen. für beide Enzyme während der stationären und exponentiellen Phase. Der Anstieg des pH-Werts führte zu einer weiteren extremen Verringerung der enzymatischen Aktivität, wobei die niedrigste enzymatische Aktivität bei pH 8 auftrat, während die enzymatische Aktivität von D. orale in der exponentiellen Wachstumsphase unter der Nachweisgrenze lag. Ein ähnlicher Trend war bei pH-Bedingungen unter 5 zu beobachten, bei denen die enzymatische Aktivität während der Exponentialphase in beiden Bakterienstämmen nicht nachweisbar war (Abb. 2B). Offensichtlich wurde die enzymatische Aktivität durch einen pH-Wert unter 5 gehemmt, in der stationären Phase war die NADH-Peroxidase-Aktivität jedoch immer noch in sehr geringen Konzentrationen (in beiden Bakterienextrakten) nachweisbar.

Daher zeigte die Enzymaktivität in Abhängigkeit von Temperatur und pH-Wert häufig glockenförmige Kurven. Diese Enzyme funktionierten am besten bei 35 °C und einem pH-Wert von 6,5–7,0. Die enzymatische Aktivität in den zellfreien Bakterienextrakten des SRB wurde als Reaktion auf Temperatur- und pH-Änderungen verringert.

Die Untersuchung der kinetischen Eigenschaften beider Arten von Peroxidasen umfasste die Untersuchung der Reaktionsdynamik der Produktakkumulation (Abb. 3). Experimentellen Erkenntnissen zufolge tendieren die kinetischen Kurven der Peroxidaseaktivität zur Sättigung (Abb. 3A). Der Analyse der Daten zufolge stimmte die Kinetik der Peroxidaseaktivität in den sulfatreduzierenden Bakterien mit einer Reaktion nullter Ordnung zwischen 0 und 1 Minute überein (die Grafik, die die Beziehung zwischen Produktbildung und Inkubationszeit zeigt, war während dieser Zeit nahezu linear). Intervall).

Kinetische Parameter der NADH- und NADPH-Peroxidaseaktivität in den zellfreien Extrakten von D. piger Vib-7 und D. orale Rod-9, hergestellt aus verschiedenen bakteriellen Wachstumsphasen (exponentiell und stationär): Dynamik der Produktakkumulation und ihre Linearisierung der Kurven in {P/t; P} Koordinaten (Mittelwert ± SD, n = 5; R2 > 0,93; F < 0,02) (A); die Auswirkung unterschiedlicher Substratkonzentrationen (H2O2) auf die Enzymaktivität und die Linearisierung der Konzentrationskurven im Lineweaver-Burk-Diagramm, wobei V die Geschwindigkeit der Enzymreaktion und [H2O2] die Substratkonzentration ist (n = 5; R2 > 0,92; F < 0,005) (B).

Daher betrug die Inkubationszeit für Bakterienzellextrakte 2,5 Minuten. Im gesamten Zeitbereich während der exponentiellen Entwicklungsphase produzierten zellfreie Extrakte von D. piger Vib-7 mehr NADH- und NADPH-Peroxidaseprodukte als D. orale Rod-9 (38 ± 3,52 und 27 ± 2,33 µmol × mg−1 Protein). (Tabelle 1). Im Vergleich zu den NADPH-Peroxidasen der beiden Extrakte war die NADH-Peroxidaseaktivität während der ersten 1,5 Minuten in der stationären Phase sowohl von D. piger Vib-7 als auch von D. orale Rod-9 höher (Abb. 3A).

Durch Linearisierung der Daten im P/t; P-Koordinaten, die grundlegenden kinetischen Eigenschaften der Reaktion in den sulfatreduzierenden Bakterien, wurden berechnet. Die Substratkonzentration beeinflusst das kinetische Verhalten der NADH- und NADPH-Peroxidase-Aktivitäten (H2O2). Die Aktivität des untersuchten Enzyms stieg monoton an, wenn die H2O2-Konzentration von 0,5 auf 5 mM anstieg, und blieb bei Substratkonzentrationen über 2,0 mM auf dem gleichen Niveau (Plateau) (Abb. 3B).

Das Enzym war mit dem Substrat gesättigt und höhere H2O2-Dosen (2,0–5,0 mM) hatten keinen Einfluss auf seine Aktivität; es blieb konstant (Plateau). Die Tangentensteigung und -position, bei der die Abhängigkeit 1/V ist; Zur Identifizierung wurden 1/[S]-Kurven verwendet, die die vertikale Achse schneiden. Durch Linearisierung der Daten im Lineweaver-Burk-Diagramm wurden die grundlegenden kinetischen Parameter der NADH- und NADPH-Peroxidaseaktivität in D. piger Vib-7 und D. orale Rod-9 bestimmt. Beide Stämme hatten deutlich unterschiedliche NADH- und NADPH-Peroxidase-Kinetikparameter: D. orale Rod-9 und D. piger Vib-7. Die maximale Menge der Produktionsreaktion (Pmax) wurde zur Berechnung der anfänglichen (augenblicklichen) Reaktionsgeschwindigkeit (V0) der Enzyme verwendet.

Wie in Tabelle 1 gezeigt, war V0 für die NADPH-Peroxidase-Reaktion in beiden Stämmen während der exponentiellen Wachstumsphase im Vergleich zu NADH höher: D. piger Vib-7 (289 ± 27,43 µmol × min−1 × mg−1 Protein) und D. piger Vib-7 (289 ± 27,43 µmol × min−1 × mg−1 Protein) und D. oraler Rod-9 (144 ± 13,55 µmol × min−1 × mg−1 Protein). Im Gegensatz dazu war der Parameter V0 für die NADH-Peroxidase-Reaktion während der stationären Phase für die beiden eingeschlossenen Stämme D. piger Vib-7 bzw. D. orale Rod-9 mehr als doppelt und dreifach höher als NADPH. Die gleiche Beobachtung wurde bei der Produktreaktion (Pmax) beobachtet, sowohl während des exponentiellen als auch des stationären Wachstums; D. piger Vib-7 hatte im Vergleich zu D. orale Rod-9 eine höhere NADH- und NADPH-Peroxidase-Reaktion. Die Werte der Reaktionszeit (τ) während der exponentiellen Wachstumsphase waren höher (NADH-Peroxidase-Reaktion, 0,36 ± 0,29 Min.) für D. piger Vib-7, aber NADPH war höher für D. orale Rod-9 (0,19 ± 0,017 Min.). ). D. orale Rod-9 hatte im Vergleich zu einem anderen getesteten Stamm (D. piger Vib-7) höhere Werte der Reaktionszeit (τ) für beide Peroxidasereaktionen (NADH und NADPH) während der stationären Phase. Die Vmax-Werte zeigten die gleiche Tendenz, da die NADH-Werte beim D. piger-Stamm Vib-7 höher waren, die NADPH-Werte jedoch beim D. orale Rod-9-Stamm; Allerdings sind die Unterschiede während der stationären Phase nahezu vernachlässigbar.

Die Michaelis-Konstante (Km) war während der Exponentialphase für den D. piger-Stamm Vib-7, sowohl NADH als auch NADPH, niedriger. Km war während der stationären Phase für D. piger Vib-7 höher (NADH-Peroxidase-Reaktion, 1,42 ± 0,11 mM). Niedrige Km-Werte weisen auf eine hohe Affinität des Enzyms zum jeweiligen Substrat hin. Es kann berücksichtigt werden, dass die Überwachung von Km notwendig ist, um den Hemmmechanismus (kompetitiver oder nichtkompetitiver Typ) zu unterscheiden. Die beschriebenen Ergebnisse der NADH- und NADPH-Reaktionen und die kinetischen Eigenschaften des Enzyms in zellfreien Extrakten der Stämme D. piger Vib-7 und D. orale Rod-9 sind neu und wurden noch nie zuvor in der Literatur beschrieben.

Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) aller berechneten Parameter hat entsprechend dem Eigenwert zu 5 Gruppen geführt. Die erste Gruppe: Dm NADH Sta, DvNADPH EXP, Dv NADPH Sta und Dm NADPH Sta; die zweite Gruppe: Dv NADH EXP und Dm NADH EXP; die dritte Gruppe: Dv NADH Sta; die vierte Gruppe: Dm NADPH Sta; die fünfte Gruppe: Dm NADPH EXP. Exponentielle Wachstumsphasen werden hauptsächlich von den stationären Wachstumsphasen getrennt (nur DvNADPH EXP befand sich in der Gruppe mit den stationären Wachstumsphasen) (Abb. 4).

Hauptkomponentenanalyse (PCA) basierend auf kinetischen Parametern der NADH- und NADPH-Peroxidaseaktivität in den zellfreien Extrakten von D. piger Vib-7 (Dv) und D. orale Rod-9 (Dm), hergestellt aus verschiedenen Bakterienwachstumsphasen (exponentiell). (EXP) und stationär (Sta)).

Antioxidative Enzyme sind endogene Systeme, die ROS30 abfangen können. SOD, Katalase und Peroxidasen gehören zu antioxidativen Enzymen, die ebenso wie die Lipidperoxidation die intrazelluläre ROS-Bildung verhindern können46. Während Katalase Superoxidradikale in Wasser und O2 spaltet, ist Superoxiddismutase in der Lage, Superoxidradikale in H2O228 umzuwandeln.

Hämhaltige Enzyme, sogenannte Peroxidasen (EC 1.11.1.7; Wasserstoffperoxid-Oxidoreduktase), können die Oxidation von Substraten unter Verwendung von H2O247, einem nichtradikalen ROS-Produkt des regulären aeroben Stoffwechsels, katalysieren. Die hohe Menge an H2O2 könnte in reaktivere ROS (z. B. Hydroxylradikale, die Biomoleküle oxidieren können) umgewandelt werden, die Gewebe schädigen, Zelltod oder Karzinogenese sowie Alterung verursachen und sich auf Herz-Kreislauf-Erkrankungen auswirken können. Daher ist die H2O2-Fängeraktivität ein entscheidender Bestandteil der gesamten antioxidativen Aktivität48, 49.

Die Entdeckung neuer SRB-Arten führte zu erheblichen Änderungen in ihrer Taxonomie, ebenso wie in den Konzepten zum SRB-Metabolismus. Heutzutage gelten viele SRB als aerotolerante Anaerobier, und O2 könnte eine wichtige physiologische Rolle im Metabolismus von SRB spielen. Es wird vermutet, dass SRB O2 als endgültigen Elektronenakzeptor während der Synthese von ATP50, 51 verwendet. Es sollte auch beachtet werden, dass O2 einige der kritischen Enzyme von SRB hemmt, wie Laktatdehydrogenase und NAD-abhängige Alkoholdehydrogenase52.

Einige SRB sind bis zu einem gewissen Grad teilweise aerotolerant53,54,55,56, und selbst nach längerer Einwirkung von O2 können einige SRB-Arten ihr anoxisches Wachstum wieder aufnehmen. Diese aerotoleranten SRB enthalten hauptsächlich SOD und Katalase55, 57, 58. Aus früheren Experimenten wurden nicht viele Informationen über Enzyme gewonnen, die am O2-Verbrauch von SRB beteiligt sind. Die O2-Reduktionskette besteht aus einer NADH-Oxidase (NADH-Rubredoxin-Oxidoreduktase), die in D. gigas59, 60 vorhanden ist. NADH-Oxidase-Aktivitäten wurden auch in D. desulfuricans NCIB 830157 und D. vulgaris Hildenborough60 gefunden. Hardy und Hamilton55 fanden O2-Reduktionsaktivitäten in mehreren D. vulgaris, obwohl keine NADH-Oxidaseaktivität nachgewiesen wurde. Gemäß der vorherigen Arbeit wurde beobachtet, dass die O2-Reduktion bei SRB-Arten im Periplasma stattfindet und mit Cytochrom c3 zusammenhängt, wie Postgate61 für den Stamm D. desulfuricans vorgeschlagen hat. Wahrscheinlich sind mindestens drei unabhängige Systeme in der Lage, O2 in D. desulfuricans CSN zu reduzieren. Von diesen drei Systemen ist ein System nur bei niedrigen O2-Konzentrationen aktiv, wird jedoch durch hohe O2-Konzentrationen gehemmt; Die restlichen beiden Systeme sind bei allen O2-Konzentrationen aktiv38.

Es wird vermutet, dass das erstere System wahrscheinlich im Periplasma aktiv ist und mit Cytochrom c3 verknüpft ist. Die Oxidationsaktivitäten von NADH und NADPH sind in löslichen Zellextrakten bei allen O2-Konzentrationen vorhanden und diese Aktivitäten nahmen mit abnehmender O2-Konzentration ab. NADH-Oxidase-Aktivität war in allen untersuchten Stämmen vorhanden, alle reagierten ähnlich auf Änderungen der O2-Konzentrationen32, 61.

Diese Ergebnisse legen nahe, dass die SRB NADH-Oxidase enthalten, die O2 direkt zu H2O reduzieren kann, obwohl einige SRB-Stämme O2 zu H2O2 reduzieren können; H2O2 wird weiter zu H2O reduziert, da diese Stämme die NADH-Peroxidase besitzen. Untersuchte D. desulfuricans-Stämme enthielten NADH- und NADPH-Oxidasen und Peroxidasen38, daher stimmen diese Ergebnisse mit unserer Forschung überein, die D. piger Vib-7 und D. orale Rod-9 umfasste, wo auch die Aktivität dieser Enzyme beobachtet wurde.

In der Forschung von van Niel et al. akkumulieren diese Stämme während des Wachstums mit verschiedenen Substraten keine Polyglucose. Diese Eigenschaften unterscheiden sie von den folgenden Stämmen: D. salexigens und D. gigas. In allen Fällen führte die Zugabe von Substraten zu einem raschen Rückgang der NADH-Oxidase-Aktivität. Die gleiche Beobachtung wurde bei NADPH-Oxidase, NADH-Peroxidase und NADPH-Peroxidase beobachtet, ebenso wie beim O2-Verbrauch durch die gesamten Zellen von D. desulfuricans-Stämmen. Es ist möglich, dass bei Oxidationsreaktionen mit O2 reaktive Zwischenprodukte entstehen, die das Enzym schädigen. Je umfangreicher die Schädigung und damit die Inaktivierung ist, desto schneller erfolgt die Oxidation38.

Die fakultativ anaeroben Bakterienstämme Lactobacillus casei IGM394 tragen mehrere Gene, die es dem Stamm ermöglichen, O2 und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zu tolerieren, obwohl die vollständigen Funktionen noch nicht bekannt sind. Bei der NADH-Peroxidase wurden im Vergleich zu Wildtypen ein verringertes Wachstum und eine hohe H2O2-Anreicherung beobachtet. Aufgrund der H2O2-Abbaukapazität wurde festgestellt, dass NADH-Peroxidase ein wichtiges H2O2-abbauendes Enzym in L. casei IGM394 ist. Umgekehrt ist der H2O2-Toleranzmechanismus in L. casei IGM39462 nur von der NADH-Peroxidase abhängig.

Die Inaktivierung in diesem Organismus wird als intrinsische Eigenschaft der Enzyme und ihrer Substrate angesehen. Eine Inaktivierung erfolgt nur, wenn sowohl oxidierbare Substrate als auch O2 vorhanden sind. Den Ergebnissen zufolge neigt der Enzym-Substrat-Komplex zur Denaturierung. Die NADH-Oxidasen von Enterococcus faecalis gehören zu den am besten untersuchten. Die NADH-Oxidasen von D. gigas60 und E. faecalis63 enthalten beide FAD, keine Zentralmetallionen und sind empfindlich gegenüber Sulfhydrylmitteln. Die allmähliche Entfernung von FAD ist der Grund für die Instabilität der NADH-Oxidase von S. faecalis64. Die Zugabe von FAD zu den Zellextrakten erhöhte zwar die Oxidationsrate von NADH, hatte jedoch keinen Einfluss auf die Inaktivierungsrate. Die Experimente wurden auch am mutierten Stamm durchgeführt, bei dem NADH-Peroxidase-Aktivität beobachtet wurde, jedoch nicht am Wildtyp. NADH-Peroxidase-Aktivitäten in In-vitro-Systemen, die NADH-Wasserstoffperoxid und eine bakterielle NADH-Oxidoreduktase aus Desulfovibrio vulgaris und Clostridium perfringens enthalten, wurden ebenfalls gezeigt65.

Desulfovibrio-Arten (SRB-Gruppe) sind allgegenwärtige anaerobe Mikroorganismen und weisen eine große Stoffwechselvielfalt auf4, 18, 22, 66,67,68. Alle SRB-Mitglieder sind sich einig, weil sie Sulfat als terminalen Elektronenakzeptor verwenden und es zu H2S reduzieren. Obwohl SRB-Arten als streng anaerob eingestuft werden, sind sie in der Lage, mit der vorübergehenden Präsenz von O2 umzugehen (in natürlichen Lebensräumen wie Meeresoberflächengewässern, mikrobiellen Matten, Abwasserkanälen, Reisfeldern und Ölpipelines), und es wurden mehrere Desulfovibrio-Arten gefunden um organische Substrate bei niedrigen O269-Konzentrationen oxidieren zu können. Andernfalls können aerotolerante Desulfovibrio O2 nicht für das Wachstum nutzen50, daher reagieren SRB in Gegenwart von Sulfid empfindlicher auf O253.

Um weitere Erkenntnisse über Peroxidasen in SRB zu gewinnen, haben wir die Genome eng verwandter Organismen untersucht. Trotz unserer Bemühungen, konkretere Informationen zu ermitteln, sind die Ergebnisse die folgenden. Bei NCBI ist nur ein Refseq-Genom für Desulfomicrobium orale (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NZ_CP014230.1) verfügbar. Es wurde festgestellt, dass die Gene von Desulfomicrobium orale für eine mutmaßliche Peroxidase vom Dyp-Typ (WP_066605144.1), eine mutmaßliche Thiolperoxidase (WP_066607718.1), eine mutmaßliche Superoxiddismutase (WP_066603707.1) und zwei mutmaßliche Peroxireducine (WP_066605219.1) kodieren; WP_066606413.1). Was jedoch für unsere Studie relevanter ist, ist, dass im Genom mehrere Oxidoreduktasen kodiert sind, beispielsweise zwei mutmaßliche FAD-abhängige Oxidoreduktasen (WP_066608725.1; WP_066606935.1; WP_066605517.1) und zwei NAD(P)/FAD-abhängige Oxidoreduktasen (WP_066604797.1; WP_151192312.1) und zwei NAD(P)-abhängige Oxidoreduktasen (WP_066606986.1; WP_066607102.1). Aus unserer Sicht könnte die Annahme sinnvoll sein, dass die letzten fünf Enzyme bei den untersuchten spezifischen Enzymaktivitäten eine Rolle spielen könnten. Dennoch deuten die von der automatisierten Genomannotationspipeline vorhergesagten Enzymmerkmale nicht unbedingt auf eine direkte Beteiligung dieser Enzyme an Peroxidasefunktionen hin. Die Identifizierung der Enzymeigenschaften würde die Klonierung, Expression und Charakterisierung jedes der vermuteten Enzyme erfordern. Alternativ könnte ein anderer Ansatz darin bestehen, die relevanten mutmaßlichen Peroxidasen durch Transkriptomik im Rahmen spezifischer Wachstumsexperimente zu lokalisieren. Es wäre interessant, beide Wege in zukünftigen Studien zu verfolgen. Unsere Studie befasst sich jedoch nicht primär mit einem bioinformatischen Ansatz mit den genetischen Eigenschaften der untersuchten Enzyme. Am NCBI ist auch das Genom eines eng verwandten Desulfovibrio-Schweins verfügbar. Dieses Genom ist kein Refseq-Genom. Obwohl wir uns bemüht haben, die Informationen zu finden, haben wir die Ergebnisse der automatisierten Annotationspipeline für dieses Genom nicht untersucht. Darüber hinaus führten wir eine zusätzliche Literaturrecherche durch, um festzustellen, ob Peroxidaseaktivitäten zuvor für andere SRB berichtet wurden. Bedauerlicherweise wurden keine Aufzeichnungen zu diesem Aspekt gefunden. Daher wurde die Aktivität der NADH- und NADPH-Peroxidasen bisher ebenfalls nicht getestet. Es besteht insgesamt ein Mangel an Informationen zu Peroxidasen in Umwelt-SRB. In Bezug auf SRB in der Umwelt könnte das Vorhandensein von Peroxidasen von dem jeweiligen untersuchten Stamm oder der untersuchten Spezies abhängen. Einige SRB verfügen möglicherweise über Peroxidasen als Teil ihrer Stoffwechselwege, während andere möglicherweise auf alternative Enzyme oder Mechanismen zur Bewältigung von oxidativem Stress angewiesen sind.

NADH- und NADPH-Peroxidasen sind wichtige Enzyme, die vermutlich an den antioxidativen Abwehrsystemen des intestinalen SRB beteiligt sind. Beide Peroxidasen könnten eine evolutionäre Reaktion auf oxidativen Stress darstellen und ihre Aktivität über einen breiten Temperatur- und pH-Bereich aufrechterhalten, den Prozess der dissimilatorischen Sulfatreduktion und die Produktion von H2S unterstützen. Bei 35 °C und pH 7,0 wurden die maximalen spezifischen enzymatischen Aktivitäten gefunden.

Im Fall von D. piger Vib-7 waren die kinetischen Parameter der enzymspezifischen Aktivität, einschließlich V0 und Vmax, im Vergleich zu D. orale Rod-9 signifikant höher. Die Konzentrationen des Substrats (H2O2) beeinflussten die kinetischen Parameter von Enzymreaktionen. Zwischen D. piger Vib-7 und D. orale Rod-9 waren die Km-Werte während der exponentiellen und stationären Wachstumsphase deutlich unterschiedlich. Die NADH-Peroxidase von D. piger Vib-7 ist die Ausnahme von diesem Befund. D. orale Rod-9 zeigte in beiden Phasen viel höhere km.

Da D. piger Vib-7- und D. orale Rod-9-Peroxidasen an ihren jeweiligen Metabolismen sowie an der dissimilatorischen Sulfatreduktion und der Produktion von H2S beteiligt sein könnten, können die erhaltenen Ergebnisse als wichtige Erkenntnisse und Perspektiven zur Klärung angesehen werden die ätiologische Rolle bei der Entstehung von Darmerkrankungen bei Mensch und Tier.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Studie wurde von der Grant Agency der Masaryk-Universität unterstützt (MUNI/A/1280/2022). Open-Access-Förderung durch die Universität Wien.

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Ivan Kushkevych & Monika Vítězová

Abteilung für Lebensmittelwissenschaften pflanzlichen Ursprungs, Fakultät für Veterinärhygiene und Ökologie, Veterinärmedizinische Universität Brünn, Palackého tř. 1946/1, 612 42, Brünn, Tschechische Republik

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Mohammad I. Alberfkani

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Eszter Ostorházi

Archaea Physiology & Biotechnology Group, Abteilung für funktionelle und evolutionäre Ökologie, Universität Wien, 1090, Wien, Österreich

Simon K.-MR Rittmann

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Alle Autoren dieses Papiers haben dazu beigetragen: IK, DD, MA, MG, EO, MV und SK-MRR analysierten und interpretierten Daten von Illumina; IK, DD, MA, MG Konzeptualisierung, Methodik und Untersuchung dieser Studie; Kuratierung und Untersuchung von IK-, DD- und MV-Daten, IK-, DD-, MA-, MG-, EO-, MV- und SK-MRR-Verfassen der Originalentwurfsvorbereitung, Verfassen von Manuskripten und Bearbeiten. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Ivan Kushkevych oder Simon K.-MR Rittmann.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kushkevych, I., Dordević, D., Alberfkani, MI et al. NADH- und NADPH-Peroxidasen als antioxidative Abwehrmechanismen in sulfatreduzierenden Darmbakterien. Sci Rep 13, 13922 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41185-3

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Eingegangen: 08. März 2023

Angenommen: 23. August 2023

Veröffentlicht: 25. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41185-3

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