Ein Lignin

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4866 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Lignozellulose-Bioraffinerieindustrie kann einen wichtigen Beitrag zur Erreichung der globalen CO2-Netto-Null-Ziele leisten. Allerdings schränkt die geringe Verwertung des Abfalllignins die Nachhaltigkeit von Bioraffinerien erheblich ein. Durch eine hydrothermale Reaktion haben wir schwefelsaures Lignin (SAL) in ein wasserlösliches hydrothermales SAL (HSAL) umgewandelt. Hier zeigen wir die Verbesserung der Bioverfügbarkeit und des Wachstums von Pflanzennährstoffen durch HSAL durch seine Fähigkeit zur Metallchelatbildung. Wir charakterisieren das hohe Verhältnis von phenolischen Hydroxylgruppen zu Methoxygruppen und seine Fähigkeit, Metallionen zu chelatisieren. Die Anwendung von HSAL fördert die Wurzellänge und das Pflanzenwachstum sowohl einkeimblättriger als auch zweikeimblättriger Pflanzenarten erheblich, da die Bioverfügbarkeit der Nährstoffe verbessert wird. Der HSAL-vermittelte Anstieg der Eisenbioverfügbarkeit ist vergleichbar mit dem bekannten Metallchelatbildner Ethylendiamintetraessigsäure. Daher verspricht HSAL, ein nachhaltiger Nährstoffchelatbildner zu sein, der eine attraktive Möglichkeit für die nachhaltige Nutzung des Abfalllignins aus der Bioraffinerieindustrie bietet.

Der Biomasseraffineriesektor stellt einen wichtigen Bestandteil einer nachhaltigen Bioökonomie dar und hat sich rasant entwickelt1. Lignozellulose-Biomasse gilt als ideale Biomasse für die Raffinierung von Rohstoffen für Biokraftstoffe und andere Produkte, da der jährliche Ertrag von etwa 200 Milliarden Tonnen keine Konkurrenz für menschliche Nahrung oder Tierfutter darstellt2. Lignin macht 15–40 % des gesamten Kohlenstoffs aus, der in der Lignozellulose-Biomasse enthalten ist3. Lignin stellt zudem die größte Quelle natürlicher aromatischer Polymere dar und birgt großes Potenzial als Ausgangsstoff für viele biobasierte Produkte4. Allerdings wird Lignin aufgrund seiner heterogenen chemischen Struktur mit komplexen und variablen Verknüpfungen meist als ungünstiger Störfaktor angesehen und als Abfallprodukt aus der Bioraffinerieanlage ausgeschleust5. Darüber hinaus wird der Großteil des Lignins nicht isoliert, sondern vor Ort verbrannt, was zu den größten Kohlenstoffemissionen bei der Raffinierung von Lignozellulose-Biomasse führt6. Um diese Ineffizienz in der Biomasseraffinierungsindustrie zu überwinden, wurden verschiedene Technologien zur Ligninverwertung entwickelt, darunter Pyrolyse, basenkatalysierte oder säurekatalysierte Hydrogenolyse und Oxidation. Zu den aktuellen Produkten zur Ligninverwertung gehören kostengünstige Kohlenstofffasern, pflanzliche Kunststoffe, fungible Brennstoffe und Grundchemikalien6. Allerdings machen diese aus Lignin gewonnenen Materialien nur etwa 2 % des gesamten industriellen Lignins (50 Millionen Tonnen) aus und werden kaum in der Lage sein, die schnell wachsende Menge an industriellem Lignin zu bewältigen7. Ohne einen nachhaltigen Weg zur Nutzung dieses industriellen Lignins wird die Biomasseraffinerieindustrie weiterhin eine erhebliche Quelle von CO2-Emissionen und Abfall bleiben, während gleichzeitig eine erhebliche Menge Lignin nicht verwertet werden kann8.

Etwa ein Drittel der Weltbevölkerung ist von verstecktem Hunger oder Mikronährstoffmangelernährung betroffen. Dies ist vor allem auf unzureichende Mikronährstoffe wie Eisen, Kalzium und Zink in den kalorienreichen Grundnahrungsmitteln zurückzuführen, die diese Menschen hauptsächlich konsumieren9. Ein zentraler Ansatz zur Reduzierung des versteckten Hungers besteht darin, den Mikronährstoffgehalt dieser Grundnahrungsmittel durch landwirtschaftliche Technologien oder Biofortifizierung zu erhöhen10. Eisenmangel ist eine der häufigsten Ursachen für versteckten Hunger11. Dies ist auf die geringe Bioverfügbarkeit von Eisen in alkalischen Böden zurückzuführen, die 25–40 % der Ackerfläche ausmachen, da eine geringe Bioverfügbarkeit von Eisen in Böden nicht nur den Ernteertrag erheblich verringert, sondern auch die potenzielle Zunahme der Eisenanreicherung in Nahrungspflanzen begrenzt12. Der Mikronährstoffmangel in Nahrungspflanzen wird aufgrund der übermäßigen Zufuhr von Makronährstoffen wie Stickstoff und Phosphat und dem steigenden CO2-Gehalt in der Atmosphäre immer schwerwiegender13. Um dem entgegenzuwirken, können chemische Verbindungen wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) als Düngemittelzusätze verwendet werden, um die Bioverfügbarkeit von Metallionen wirksam zu verbessern und die Anreicherung von Metallnährstoffen in Nahrungspflanzen zu erhöhen14. Allerdings sind diese Düngemittelzusätze kostspielig und können erhebliche Umweltschäden verursachen, da sie nicht biologisch abbaubar sind und dadurch zu einer Schwermetallbelastung führen15. Lignin verfügt über mehrere aktive funktionelle Gruppen, darunter aliphatische Hydroxyl-, Carbonyl- und phenolische Hydroxylgruppen sowie ein ungeteiltes Elektronenpaar am Sauerstoffatom, die alle an der Chelatbildung von Metallionen beteiligt sind. Natürliche Ligninverbindungen sind die größte Versorgungsquelle der Huminstoffe16. Huminstoffe in Böden sind natürliche Chelate, die die Bioverfügbarkeit von Metallnährstoffen erhöhen und dazu beitragen, Phänotypen von Metallnährstoffmangel bei Pflanzen zu vermeiden17. Ligninsulfonat wurde auch zur Synthese von Ligninsulfonat-Eisen verwendet18. Zusammengenommen deutet dies darauf hin, dass aus Lignin gewonnene Materialien das Potenzial haben, als Metallchelatbildner verwendet zu werden und die Bioverfügbarkeit von Nährstoffen zu verbessern. Der Zusatz von industriellem Lignin zu Düngemitteln erregte jedoch im Bereich der Ligninverwertung keine große Aufmerksamkeit19.

Schwefelsäurehydrolyse und enzymatische Hydrolyse sind zwei Hauptstrategien zur Herstellung von Monosacchariden in kommerziellen Bioraffinerien20. Schwefelsäurelignin (SAL, erzeugt durch Schwefelsäurehydrolyse) und enzymatisches Hydrolyselignin (erzeugt durch enzymvermittelte Hydrolyse) sind die wichtigsten Ligninnebenprodukte aus der Bioraffinerie21. Beide Arten von Lignin weisen aufgrund ihrer hohen Molekulargewichte und hochkondensierten Strukturen22 eine sehr geringe Löslichkeit sowohl in Wasser als auch in organischen Lösungsmitteln auf (dies ist bei SAL aufgrund der Repolymerisations- und Kondensationsreaktionen stärker). Dies schränkt die Verwertung des Abfalllignins ein und schränkt die nachhaltige Entwicklung der Lignozellulose-Bioraffinerie ein23,24. Daher stellt SAL einen säureunlöslichen Ligninrestanteil dar, der aus der Polysaccharidumwandlung von Lignocellulose-Biomasse durch Acidolyse mit konzentrierter Schwefelsäure gewonnen wird25. In einer früheren Studie haben wir hochreines SAL, das mit der Klason-Methode hergestellt wurde, um industrielles SAL zu simulieren, mithilfe einer alkalischen hydrothermischen Reaktion in wasserlösliche Ligninfragmente umgewandelt, die als hydrothermales Schwefelsäurelignin (HSAL) bezeichnet werden26. Hier haben wir gezeigt, dass diese hydrothermale Reaktion nicht nur SAL depolymerisiert, sondern auch Methoxygruppen stark reduziert und den Anteil der phenolischen Hydroxylgruppen von Lignin erhöht, was HASL eine signifikante Fähigkeit zur Chelatisierung von Metallionen verleiht. Wir fanden heraus, dass die Zugabe von HSAL zu nährstoffarmen Wachstumsmedien und Böden das Wachstum sowohl einkeimblättriger als auch zweikeimblättriger Pflanzenarten, einschließlich Reis, Mais und Arabidopsis thaliana, erheblich fördern kann. Durch die Kombination von Transkriptomik, Genetik und physiologischen Ansätzen haben wir herausgefunden, dass die Förderung von HSAL auf das Wurzelwachstum in erster Linie durch die Verbesserung der Bioverfügbarkeit von Metallnährstoffen vorangetrieben wird. Die HSAL-vermittelte Erhöhung der Eisenbioverfügbarkeit ist vergleichbar mit dem bekannten, aber nicht biologisch abbaubaren Metallchelatbildner EDTA. Daher kann HSAL als vielversprechender nachhaltiger Metallchelatbildner dienen, der synthetische Chelatbildner ersetzt, und verspricht nicht nur, die Rentabilität und Nachhaltigkeit von Bioraffinerien zu fördern, sondern auch, in Zukunft mehr Kohlenstoff im Untergrund zu binden.

Wir haben SAL durch eine alkalische hydrothermale Reaktion bei 280 °C für 2 Stunden mit einer gleichen Menge NaOH in eine flüssige Mischung umgewandelt. Nach dem Entfernen anorganischer Reagenzien und dem Filtrieren mit einem Zelluloseröhrchen bei einem Molekulargewichtsgrenzwert von 3500 wurde die flüssige Form des hydrothermisch behandelten SAL (HSAL) gesammelt und zu einem Pulver lyophilisiert26. Wie erwartet lässt sich das HSAL-Pulver bei Raumtemperatur in neutralem Wasser vollständig lösen (die Löslichkeit beträgt etwa 3 Gramm pro 100 ml) (Abb. 1a).

eine Synthese von HSAL. Während der Säurehydrolyse von Lignozellulose-Biomasse wurde Schwefelsäure-Lignin (SAL, Ausbeute 35,2 Gew.-%, bezogen auf Lignozellulose-Biomasse) durch eine milde hydrothermale Reaktion in das wasserlösliche Ligninmaterial HSAL (Ausbeute 46,7 Gew.-%, bezogen auf SAL) umgewandelt. b: Die Spektren der Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FT-IR) zeigten den Unterschied der Methoxygruppen und Hydroxygruppen zwischen SAL und HSAL. Der rote Stern zeigt die Absorption von Methoxygruppen bei 1465 cm−1 an; Der blaue Bereich zeigt die Absorption von Hydroxygruppen zwischen 3200 und 3500 cm−1 an. c Methoxygruppengehalt in SAL und HSAL. d Messung phenolischer Hydroxygruppen und alkoholischer Hydroxygruppen von HSAL mithilfe von Kernspinresonanzspektren (NMR). e Quantifizierung des Hydroxygruppengehalts von HSAL in d. f Quantifizierung des Hydroxygruppengehalts von SAL. P-OH, phenolische Hydroxylgruppe; A-OH, alkoholische Hydroxygruppe. g Modelldiagramm von Ligninmonomer-Struktureinheiten während der HSAL-Synthese mit der Änderung von Methoxygruppen und phenolischen Hydroxygruppen. Die Diagramme zeigen Mittelwert und Standardabweichung (Fehlerbalken) sowie einzelne Datenpunkte. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Mittelwerten wurden mit dem Student-t-Test (n = 3 unabhängige Experimente) in (c, e, f) analysiert.

Die Wasserlöslichkeit von Lignin hängt vom Grad der Depolymerisation, dem Demethoxy- und phenolischen Hydroxylgehalt sowie den Carboxylgruppen ab27. Da die Carboxylgruppen bei dieser hydrothermischen Reaktion eine intensive und gründliche Decarboxylierungsreaktion durchlaufen28, können die Carboxylgruppen in HSAL22 ignoriert werden. In früheren Studien haben wir gezeigt, dass diese hydrothermale Reaktion Kohlenstoff-Sauerstoff-Kohlenstoff-Bindungen, Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen und Alkyl-Arylether-Bindungen der aromatischen Kernstruktur spalten kann, indem wir oligomere Lignin-Modellverbindungen mit β-O-4-Bindung22 und Polymeren verwenden Lignin-Modellverbindungen29. Dieser Befund wurde teilweise durch die Verringerung des durchschnittlichen Molekulargewichts von 57 kDa bei SAL auf 7,5 kDa bei HSAL gestützt. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die hydrothermale Reaktion die Kohlenstoff-Sauerstoff-Kohlenstoff-Bindungen und die Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen, die die Ligninmonomere verbinden, wirksam schert, um die Depolymerisation von SAL zu erhöhen. Um den Gesamteffekt der hydrothermischen Reaktion auf die funktionellen Gruppen von SAL zu verstehen, wurde Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FT-IR) eingesetzt, um die funktionellen Gruppen zwischen SAL und HSAL zu vergleichen. FT-IR-Spektren zeigten, dass im Vergleich zu SAL die Absorption von Methoxygruppen bei 1465 cm−1 bei HSAL verringert war, während die Absorption von Hydroxygruppen bei 3200–3500 cm−1 bei HSAL stark anstieg (Abb. 1b). Die Quantifizierungsanalyse zeigte, dass der Methoxygruppengehalt von HSAL 1,91 mmol/g betrug, was viel weniger als 5,91 mmol/g in SAL war (Abb. 1c). Die Quantifizierung der Hydroxygruppen zeigte, dass die gesamten phenolischen Hydroxylgruppen in SAL 2,20 mmol/g betrugen und in HSAL auf 5,42 mmol/g anstiegen, während die Menge an alkoholischen Hydroxygruppen in HSAL im Vergleich zu SAL stark reduziert war (Abb. 1d–f und). Ergänzende Abbildung 1). Konsistent betrug der Anteil der Methoxygruppen pro hundert Phenylpropaneinheiten 0,98–1,08 in SAL und wurde auf 0,32–0,35 in HSAL reduziert, während der Anteil phenolischer Hydroxylgruppen pro hundert Phenylpropaneinheiten von HSAL (0,9–0,99) viel höher war von SAL (0,36–0,4) und natürlichem Weichholzlignin (0,15–0,30) (Abb. 1g). Zusammengenommen stützen diese Ergebnisse die Annahme, dass die hydrothermale Reaktion nicht nur die Kohlenstoff-Sauerstoff-Kohlenstoff-Bindungen und Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen zwischen Ligninmonomeren aufbricht, sondern höchstwahrscheinlich auch die Alkyl-Arylether-Bindungen der aromatischen Kernstruktur spaltet, um die Methoxygruppe zu reduzieren Gruppe und um die Positionen für phenolische Hydroxylgruppen freizugeben, was zur Wasserlöslichkeit von HSAL führt.

Das erhöhte Verhältnis von phenolischen Hydroxylgruppen zu Methoxygruppen von HSAL-Monomereinheiten ähnelt der Struktur von Huminstoffen, die als natürliche Nährstoffchelatoren wirken können30. Dies veranlasste uns, die Fähigkeit von HSAL zur Metallchelatbildung zu testen. Wir haben verschiedene Chelatkomplexe für HSAL mit FeSO4, FeCl3 bzw. CaCl2 hergestellt. Im Gegensatz zur porösen lockeren Struktur von HSAL zeigte der Chelatkomplex von HSAL mit FeSO4 eine feinsandige Textur, während die Chelatkomplexe von HSAL mit FeCl3 und CaCl2 ein flauschigeres Aussehen zeigten (Abb. 2a). Die morphologische Veränderung dieser Chelatkomplexe deutete auf eine erfolgreiche Chelatbildung von HSAL mit Metallverbindungen hin. Wir haben auch Elementaranalysen von HSAL und HSAL-Metallkomplexen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass der Eisengehalt in HSAL-FeSO4 und HSAL-FeCl3 deutlich höher ist, während der Kalziumgehalt in HSAL-CaCl2 im Vergleich zu HSAL ebenfalls viel höher ist (Ergänzungstabelle 1). Dieses Ergebnis bestätigte, dass HSAL Eisen und Kalzium chelatisieren kann.

a Repräsentative Bilder von HSAL-Pulver und HSAL chelatisiert mit FeSO4, FeCl3 bzw. CaCl2. b Röntgenphotoelektronenspektrometer (XPS)-Spektren von HSAL und HSAL chelatisiert mit FeSO4 oder FeCl3. Die Positionen der Fe(2p1/2)- und Fe(2p3/2)-Peaks lagen bei 723,3–723,9 eV bzw. 709,7–710,6 eV. c XPS-Spektren von HSAL und mit CaCl2 chelatisiertem HSAL. Die Positionen der Ca(2p1/2)- und Ca(2p3/2)-Peaks betrugen 349,5–350,0 eV bzw. 346,5–347,0 eV. d FT-IR-Spektrenvergleiche von HSAL, HSAL chelatisiert mit FeSO4 oder FeCl3. Die FT-IR-Spektren bei 3360 cm-1 für die OH-Bande von HSAL wurden auf 3320 cm-1 und 3410 cm-1 für die Chelatkomplexe von HSAL mit FeSO4 bzw. FeCl3 verschoben. Zwei markante Banden bei 665 cm−1 und 1220 cm−1 für die Chelatkomplexe von HSAL mit FeSO4 und FeCl3 entsprachen den Fe-O-Streckschwingungen bzw. CO der Guajakol-Streckschwingung. e FT-IR-Spektrenvergleiche von HSAL und mit CaCl2 chelatisiertem HSAL. Die FT-IR-Spektren der OH-Bande bei 3360 cm−1 für HSAL wurden für die Chelatkomplexe von HSAL mit CaCl2 auf 3400 cm−1 verschoben. Zwei neue Banden bei 1200 cm−1 und 3640 cm−1 wurden wahrscheinlich dem CO der Guajakol-Streckung bzw. der Calciumhydroxid-Streckung zugeordnet. f Vergleiche der Metallchelatisierungsfähigkeit von HSAL und EDTA mittels komplexometrischer Titrationsanalyse. Die Diagramme zeigen Mittelwert und Standardabweichung (Fehlerbalken). Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Mittelwerten wurden mit dem Student-t-Test analysiert (n = 3 unabhängige Experimente).

Wir haben die Elementzusammensetzung und den Elementvalenzzustand von HSAL und den Chelatkomplexen von HSAL mit verschiedenen Metallverbindungen mithilfe eines Röntgenphotoelektronenspektrometers (XPS) basierend auf der spezifischen Bindungsenergie weiter untersucht. Die Bindungsenergie für Fe(2p3/2) aus FeSO4 liegt zwischen 711,9 und 712,3 eV, während die für Fe(2p3/2) aus FeCl3 bei etwa 711,0–711,5 eV liegt31. Wie in Abb. 2b gezeigt, verschob sich der Fe 2p-Peak für die Chelatkomplexe von HSAL mit FeSO4 und FeCl3 auf 709,7–710,6 eV und 723,3–723,9 eV, was Fe(2p3/2) und Fe(2p1/2) entsprach. jeweils, während kein entsprechender Peak für HSAL festgestellt wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass FeCl3 und FeSO4 erfolgreich durch HSAL chelatisiert wurden. Die Bindungsenergie von Ca(2p3/2) von CaCl2 liegt zwischen 347,9 und 348,6 eV32. Die Bindungsenergie von Ca 2p für den Chelatkomplex von HSAL mit CaCl2 wurde in zwei Hauptpeaks bei 346,5–347,0 eV und 349,5–350,0 eV aufgelöst, die Ca(2p3/2) bzw. Ca (2p1/2) entsprachen ( Abb. 2c). Dieses Ergebnis zeigte, dass HSAL auch erfolgreich mit CaCl2 chelatieren kann.

Um die Gruppen von HSAL zu definieren, die an der Chelatbildung mit Metallen beteiligt sind, führten wir eine FT-IR-Spektrenanalyse für HSAL und seine Chelatkomplexe mit FeCl3, FeSO4 und CaCl2 durch (Abb. 2d, e). Die OH-Streckung (H-gebunden) von HSAL lag bei 3360 cm−1, während sie für die Chelatkomplexe von HSAL mit FeSO4 und FeCl3 auf 3320 cm−1 und 3410 cm−1 verschoben war (Abb. 2d). Darüber hinaus wurden zwei neue Banden für jeden Chelatkomplex von HSAL mit FeSO4 und FeCl3 bei 665 cm−1 und 1220 cm−1 beobachtet, die den Fe-O-Streckschwingungen bzw. der CO-Bindung der Guajakol-Streckschwingung entsprechen. Da die CO-Bindung der Guajakolstruktur hauptsächlich von phenolischen Hydroxylgruppen in HSAL herrührt, dienten phenolische Hydroxylgruppen wahrscheinlich als Hauptchelatisierungsstellen für die HSAL-Bindung an Eisen(III)-Eisen. Im Chelatkomplex von HSAL mit CaCl2 wurde die Bande der OH-Streckschwingung (H-Brücke) von 3360 cm−1 auf 3400 cm−1 verschoben (Abb. 2e). Darüber hinaus wurden im Chelatkomplex von HSAL mit CaCl2 zwei neue Bindungen im FT-IR-Spektrum um 1200 cm−1 und 3640 cm−1 beobachtet, die wahrscheinlich dem C–O der Guajakol-Streckschwingung und dem O zugeordnet werden können –H-Bindungen (freie Hydroxylgruppe) aus Calciumhydroxid33, da Calciumchlorid das verbleibende Hydroxid in den Chelatkomplexen verbindet. Diese Ergebnisse zeigten, dass die O-H-Bindung für die Chelatbildung von HSAL mit FeSO4, FeCl3 und CaCl2 wichtig ist, während die durch die phenolische Hydroxylgruppe bereitgestellte CO-Bindung spezifischer für die Chelatbildung von HSAL mit FeCl3 und CaCl2 zu sein scheint. Um die Chelatisierungskapazität von HSAL zu quantifizieren, haben wir die Kapazität von HSAL zur Chelatisierung mit FeCl3 und CaCl2 mithilfe einer chelatometrischen Titrationsanalyse gemessen und sie mit dem bekannten Chelator EDTA verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Fähigkeit von HSAL, Fe3+ zu chelatisieren, 101,9 mg betrug. g−1, etwas niedriger als der von EDTA (138,8 mg g−1) (p = 9,3E-04). Die Fähigkeit von HSAL, Ca2+ zu chelatisieren, betrug 69,7 mg g-1, während die von EDTA 173,8 mg g-1 betrug (Abb. 2f) (p = 3,0E-05). Da das durchschnittliche Molekulargewicht von HSAL (7,5 kDa) 25,6-fach höher als das von EDTA ist, können äquimolare Mengen von HSAL mehr Metalle chelatisieren als EDTA. Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass HSAL über die Fähigkeit zur Metallchelatbildung verfügt.

Da die anorganischen Phasen aufgrund der Anwesenheit von freiem NaOH34,35 kristalline Hybridmaterialien bilden könnten, haben wir HSAL und seine Chelatkomplexe mit FeCl3 als Beispiele genommen, um eine Röntgenpulverbeugungsanalyse (XRPD) und eine energiedispersive Röntgenanalyse mit dem Transmissionselektronenmikroskop durchzuführen. Strahlenspektrometeranalyse (TEM-EDS), um zu untersuchen, ob die HSAL-Metall-Chelatkomplexe Hybridmaterialien aus HSAL und anorganischen Phasen bilden können. Wie in der ergänzenden Abbildung 2a gezeigt, zeigte die XRPD-Spur von HSAL und HSAL-FeCl3 einen glatten Kamm, was auf die amorphe Natur von HSAL und HSAL-FeCl3 hinweist. Die TEM-EDS-Bilder von HSAL- und HSAL-FeCl3-Komplexen zeigten keine Verteilung der hellen Punktaggregation, was auch die amorphe Natur von HSAL- und HSAL-FeCl3-Komplexen unterstützte (ergänzende Abbildung 2b, c). Zusammengenommen schließen diese Ergebnisse die Möglichkeit aus, dass diese chelatisierten Metallverbindungen Oxidkristalle bilden, die in die Polymermatrix von HSAL eingebettet sind.

Metallchelatoren, darunter synthetisches EDTA und natürliche Huminstoffe, wurden mit einem gesteigerten Pflanzenwachstum unter nährstoffarmen Bedingungen in Verbindung gebracht36. Um eine mögliche positive Wirkung von HSAL auf das Pflanzenwachstum aufzuzeigen, haben wir die Wirkung verschiedener Konzentrationen von HSAL (Kontrolle, 0,01 %, 0,05 % und 0,1 %) auf das frühe Wachstum von Reissämlingen (Oryza sativa L. ssp. japonica cv.) getestet . Nipponbare) in Wasser ohne zusätzliche Nährstoffe angebaut. Alle Behandlungen mit HSAL für 14 Tage nach der Keimung führten zu einer erheblichen Zunahme der Wurzel- und Sprossbiomasse sowie der Wurzel- und Sprosslänge bei Reissämlingen (Abb. 3a – e). Die deutlichsten Zunahmen (eine 2,39-fache Zunahme der Wurzellänge (p < 0,05); eine 1,30-fache Zunahme der Wurzelbiomasse (p < 0,05) wurden bei einer Konzentration von 0,05 % HSAL beobachtet (Abb. 3b, c). A Ein ähnlich erhöhtes HSAL-Muster wurde für den Spross beobachtet (Abb. 3d, e). Durch Messung der Wurzellänge von Nipponbare-Reis, der unter Kontrollbedingungen oder mit 0,05 % HSAL pro Tag angebaut wurde, stellten wir fest, dass Unterschiede in der Wurzellänge zwischen der Kontrolle und 0,05 % HSAL HSAL konnte ab 3 Tagen nach der Keimung beobachtet werden. Darüber hinaus wuchsen die Wurzeln im Kontrollzustand nach 7 Tagen nicht mehr, sondern wuchsen bei 0,05 % HSAL weiter (Abb. 3f). Die Förderung des Sprosswachstums durch 0,05 % HSAL war bei zu beobachten ein späterer Punkt als der der Wurzel (Abb. 3g). Ein ähnliches Muster der HSAL-Wachstumsförderung wurde bei zwei anderen von uns getesteten Reisökotypen beobachtet (Oryza sativa L. japonica. var. Taichung 65 und Kasalath) (Ergänzende Abbildungen). 3 und 4). Diese Ergebnisse zeigten, dass die HSAL-vermittelte Förderung des Pflanzenwachstums bei verschiedenen Reissorten häufig vorkommt.

a Repräsentative Bilder, die Reiswurzeln (Oryza sativa Nipponbare) von Sämlingen zeigen, die 14 Tage lang mit unterschiedlichen HSAL-Konzentrationen behandelt wurden. b, c Quantifizierung der Primärwurzellänge b und der gesamten Wurzelbiomasse c der Sämlinge in a mithilfe von Boxplots und einzelnen Datenpunkten. d, e Quantifizierung der Sprosslänge d und der gesamten Sprossbiomasse e der Sämlinge in a anhand von Boxplots und einzelnen Datenpunkten. f, g Wachstumskurve an der Wurzel f und dem Spross g von Nipponbare zwischen Kontroll- und 0,05 % HSAL-Behandlungen. Liniendiagramme zeigen Mittelwert und Standardabweichung (Fehlerbalken). Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Mittelwerten wurden mit dem Student-t-Test (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001) in f, g analysiert. h Repräsentative Bilder von Maissämlingen, die in mit Kontrolllösung (-Dünger), 0,4 % Dünger (HYPONex), 0,4 % HSAL und 0,4 % HSAL + 0,4 % Dünger behandeltem Boden gewachsen sind, Maßstabsbalken = 10 cm. i, j Quantifizierung der Primärwurzellänge i und der gesamten Wurzelbiomasse j in h. k, l Quantifizierung der Sprosslänge k und der gesamten Sprossbiomasse l in h. Kästchen stellen den 25.–75. Perzentilbereich dar, weiße Linien stellen Mediane dar und Whiskers zeigen den minimalen–maximalen Bereich in b–e, i–l. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf statistisch signifikante Unterschiede basierend auf der einfaktoriellen ANOVA und der HSD-Testanalyse von Tukey hin (p < 0,05). Die in der Abbildung dargestellte Anzahl (n) der Sämlinge in b–g, i–l).

Um die Wirkung von HSAL auf das Wachstum anderer Pflanzenarten zu testen, verglichen wir das Wachstum von Maissämlingen (Zea mays L.) im Boden und verglichen Dünger- und HSAL-Behandlungen (Abb. 3h). Im Vergleich zu den im Kontrollboden gewachsenen Sämlingen wurde die Wurzellänge durch 0,4 % Dünger, 0,4 % HSAL um das 1,41-fache (p < 0,05), 2,56-fache (p < 0,05), 2,80-fache (p < 0,05) erhöht jeweils die Kombination der Behandlungen (Abb. 3i). Eine HSAL-vermittelte Wachstumsförderung von Maiskeimlingen wurde auch für Wurzelbiomasse, Sprosslänge und Sprossbiomasse beobachtet (Abb. 3j – l). Insgesamt zeigten unsere Ergebnisse, dass die Wirkung der HSAL-Förderung auf das Pflanzenwachstum bei verschiedenen Arten erhalten bleibt.

Um die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen für die HSAL-vermittelte Förderung des Wurzelwachstums aufzuklären, analysierten wir Zellzahlen, Zellgrößen und Zelllängen in Reiswurzelspitzen als Reaktion auf die 0,05 % HSAL-Behandlung. Wie in der ergänzenden Abbildung 5a gezeigt, war die Breite der mit 0,05 % HSAL behandelten Reiswurzel im Vergleich zu der der Sämlinge, die 7 Tage lang in Wasser ohne zusätzliche Nährstoffe und HSAL-Behandlung gezüchtet wurden, vergrößert. Die Gesamtzellzahl der Wurzel (Querschnittsansicht) bei 0,05 % HSAL war im Vergleich zur Kontrolle um das 1,42-fache (p = 6,8E-06) erhöht (ergänzende Abbildung 5b). Darüber hinaus wurden die radialen Zelldurchmesser erhöht, wenn sie in 0,05 % HSAL gezüchtet wurden (ergänzende Abbildung 5c). Die Längszelllänge in der reifen Zone der Reiswurzeln wurde jedoch durch die Behandlung mit 0,05 % HSAL nicht signifikant verändert (ergänzende Abbildung 5d). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Zunahme von HSAL auf die Reiswurzellänge in erster Linie auf einen Effekt der Zellproliferation und nicht auf eine erhöhte Zelllänge zurückzuführen ist.

Um zu testen, ob die Zellproliferation durch HSAL beeinflusst wird, verwendeten wir den Fluoreszenzfarbstoff 5-Ethinyl-2'-desoxyuridin (EdU), der das Vorhandensein von DNA-synthetisierenden Zellen anzeigt. Konfokale Mikroskopie von Reiswurzelmeristemen zeigte, dass die EdU-Fluoreszenz des Wurzelmeristems zwischen der Kontrolle und 0,05 % HSAL ähnlich war, wenn es drei Tage lang in der Hydrokultur kultiviert wurde. 8 Tage später verschwand die EdU-Fluoreszenz jedoch in den Wurzelmeristemen von Sämlingen ohne HSAL-Behandlung fast, wurde jedoch in den Wurzelmeristemen der mit 0, 05% HSAL behandelten Sämlinge immer noch in hohem Maße nachgewiesen (ergänzende Abbildung 5e – g). Dies deutet darauf hin, dass 0,05 % HSAL die Zellproliferationsaktivität des Wurzelmeristems über einen längeren Zeitraum aufrechterhalten kann, was mit dem Unterschied des Wurzelwachstums nach 7 Tagen bei Kontroll- und HSAL-behandelten Reispflanzen übereinstimmt (Abb. 3f). Zusammengenommen stützen diese Ergebnisse die Schlussfolgerung, dass HSAL die Zellproliferation und das Wurzelwachstum unter nährstoffarmen Bedingungen aufrechterhält, wo sonst die Zellproliferation und das Zellwachstum zum Stillstand kommen würden.

Um die molekularen und biologischen Prozesse zu bestimmen, auf die HSAL abzielt und die zu einem verstärkten Wurzelwachstum in nährstoffarmen Umgebungen führen, führten wir eine genomweite Transkriptanalyse der Wurzelspitze von 7 Tage alten Sämlingen durch, die 12 Stunden lang mit oder ohne HSAL behandelt wurden unter Verwendung von RNA-seq (Abb. 4a). Diese Analyse identifizierte 956 hochregulierte Gene und 1112 herunterregulierte Gene als Reaktion auf 0,05 % HSAL in Reiswurzelspitzen (False Discovery Rate (FDR) ≤ 0,05 und Log2(Fold Change) ≥ 1). Eine Gene Ontology (GO)-Anreicherungsanalyse identifizierte mehrere überpräsentierte Prozesse unter den differentiell exprimierten Genen (DEGs), die mit Zellwänden in Zusammenhang stehen, darunter „Lignin-Stoffwechselprozess“, „Fettsäure-Biosyntheseprozess“ und „Kohlenhydrat-Stoffwechselprozess“ (Abb . 4b, c). Interessanterweise stellten wir fest, dass mehrere GO-Elemente im Zusammenhang mit dem Transport und der Funktion von Metallnährstoffen, wie „Transmembrantransport“, „Sauerstofftransport“ und „Nicotianamin-Biosyntheseprozess“, ebenfalls signifikant angereichert waren (Abb. 4b, c). Ein ähnliches Muster der GO-Anreicherung wurde in den hochregulierten Genen gefunden (ergänzende Abbildung 6a). In den herunterregulierten Genen war der „Transmembrantransport“ der einzige angereicherte GO-Prozess (ergänzende Abbildung 6c). In der Kategorie „Molekulare Funktion“ war „Hämbindung“ das am stärksten angereicherte GO-Element in allen DEGs oder hochregulierten DEGs oder herunterregulierten DEGs (Abb. 4b, c und ergänzende Abb. 6b, c). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Bioverfügbarkeit von Eisen, einschließlich des Eisentransports und eisenbezogener biologischer Prozesse, wahrscheinlich durch die HSAL-Behandlung auf molekularer Ebene moduliert wurde. Um dies zu untermauern, fanden wir heraus, dass die Expression mehrerer am Eisentransport beteiligter Gene durch die HSAL-Behandlung signifikant induziert wurde (Abb. 4d). Die durch HSAL induzierte Expressionsänderung von Genen, die am Eisentransport beteiligt sind, wurde durch quantitative Echtzeit-Polymerasekettenreaktionsanalyse (qRT-PCR) weiter bestätigt (ergänzende Abbildung 6d) (p <0, 05). Darüber hinaus war die „Kationenbindung“ auch bei allen DEGs oder bei hochregulierten DEGs signifikant angereichert (Abb. 4c und ergänzende Abb. 6b). Insgesamt veranlasste uns die genomweite Transkriptionsanalyse zu der Hypothese, dass die Bioverfügbarkeit von Eisen durch die HSAL-Behandlung verbessert werden könnte. Diese Hypothese stimmte mit der für HSAL nachgewiesenen Metallchelatbildnerfunktion überein (Abb. 2).

ein Volcano-Plot von 2068 signifikanten differentiellen Expressionsgenen (DEGs) von Reiswurzelspitzen, die 12 Stunden lang ohne oder mit 0,05 % HSAL behandelt wurden; Signifikanzschwelle: False Discovery Rate (FDR) ≤ 0,05 und Log2 (Fold Change) ≥ 1. Die Liste der DEGs wurde im Ergänzungsdatensatz 1 angehängt. b, c Deutlich angereicherte Begriffe der Genontologie (GO) in Biological Process b und Molecular Function c Kategorien dieser DEGs. Die GO-Anreicherung wurde mit der Überrepräsentationsanalyse durchgeführt. Die p-Werte wurden durch Mehrfachvergleich der hypergeometrischen Verteilung und anschließende Benjamini-Hochberg-Anpassung berechnet. d Wärmekarte, die das Expressionsmuster von Eisentransport-bezogenen Genen zeigt, die von 0,05 % HSAL betroffen sind. e Repräsentative Bilder, die 0,05 % HSAL zeigen, beseitigen Eisenmangel-Phänotypen in Nipponbare-Reis. Reissämlinge wurden unter Eisenmangel (EDTA-Fe(II) entfernt) und ausreichend Eisen (36 µM EDTA-Fe(II)) gezüchtet und 10 Tage lang mit oder ohne 0,05 % HSAL behandelt. f, g Boxplots und Streudiagramme, die die Wurzellänge f und die Sprosslänge g von Reiskeimlingen mit und ohne 0,05 % HSAL zeigen. Kästchen stellen den 25.–75. Perzentilbereich dar, weiße Linien stellen Mediane dar und Whiskers zeigen den Minimal-Maximum-Bereich (n = 12 Sämlinge). h, i Eisengehalt in den Wurzeln h und Trieben i von Reiskeimlingen nach Behandlung mit 0,05 % HSAL. Die Diagramme zeigen den Mittelwert mit Standardabweichung (Fehlerbalken) und einzelne Datenpunkte (n = 4 biologische Replikate). Unterschiedliche Buchstaben weisen auf statistisch signifikante Unterschiede basierend auf der Zwei-Wege-ANOVA und der Tukey-HSD-Testanalyse (p < 0,05) in f–i hin.

Um diese Hypothese zu testen, haben wir Reissämlinge nach der Hydroponikmethode des IRRI (International Rice Research Institute)37 unter eisenreichen und eisenarmen Bedingungen gezüchtet und sie mit oder ohne 0,05 % HSAL gezüchtet. Die Behandlung mit 0,05 % HSAL erhöhte die Wurzellänge unter eisenarmen Bedingungen um das 2,84-fache (p < 0,05) und die Sprosslänge um das 1,82-fache (p < 0,05) (Abb. 4e–g). Bemerkenswerterweise waren die Wurzeln unter eisenarmer und HSAL-Behandlung sogar länger als diejenigen, die unter eisenarmen Bedingungen ohne HSAL wuchsen (Abb. 4e, f). Konsistent war die Eisenanreicherung in der Wurzel und im Spross um das 1,57-fache (p < 0,05) und das 1,17-fache (p < 0,05) bei 0,05 % HSAL-Behandlung unter Eisenmangelbedingungen erhöht (Abb. 4h, i). Diese Ergebnisse bestätigten, dass HSAL die Bioverfügbarkeit von Eisen verbessern kann, um das Reiswachstum unter Eisenmangelbedingungen zu unterstützen. Darüber hinaus erhöhte 0,05 % HSAL auch die Wurzel- und Sprosslänge von Reiskeimlingen unter Eisenmangelbedingungen signifikant (Abb. 4e – g). Die Eisenanreicherung in Wurzel und Spross wurde durch die Behandlung mit 0,05 % HSAL unter der Bedingung, dass ausreichend Eisen vorhanden ist, ebenfalls dramatisch um das 2,12-fache (p < 0,05) und das 2,33-fache (p < 0,05) erhöht (Abb. 4h, i). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass HSAL die Eisenverfügbarkeit für das Pflanzenwachstum sowohl unter Eisenmangel- als auch unter Eisenmangelbedingungen verbessern kann. Interessanterweise erhöhte 0,05 % HSAL auch die Anreicherung von Kalzium und Kupfer sowohl im Spross als auch in der Wurzel deutlich, während es die Anreicherung von Magnesium und Zink nur in den Wurzeln erhöhte (ergänzende Abbildung 7). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass HSAL die Bioverfügbarkeit von Metallnährstoffen, insbesondere von Eisen in Pflanzen, erheblich verbessern könnte.

Um die Möglichkeit auszuschließen, dass diese Effekte auf eine Kontamination von HSAL mit diesen Nährstoffen zurückzuführen sind, haben wir den Gehalt dieser Nährstoffe in den IRRI-Hydrokulturen mit und ohne 0,05 % HSAL verglichen. Unter der Bedingung, dass ausreichend Eisen vorhanden ist, betrug die Konzentration von Eisen und Kalzium in 0,05 % HSAL nur 0,09 % und 0,02 % der entsprechenden Elemente im IRRI-Medium (Ergänzungstabelle 2). Somit waren das in 0,05 % HSAL enthaltene Eisen und Kalzium für den Nährstoffgehalt im IRRI-Medium vernachlässigbar. Unter Eisenmangelbedingungen enthielten die Töpfe 561 µg Topf-1 Eisen, höchstwahrscheinlich durch andere chemische Verbindungen verunreinigt. Daher erhöhten 1,92 µg Topf-1 zusätzliches Eisen aus HSAL die Gesamteisenkonzentration im Wachstumsmedium um 0,05 % HSAL, was nicht den Anstieg des gesamten Pflanzeneisens um 27,75 µg Topf-1 Eisen erklärt (Ergänzungstabelle 3). Daher erhöht HSAL tatsächlich die Bioverfügbarkeit von Eisen, um die Eisenanreicherung im Reis zu verbessern.

Während die einkeimblättrige Pflanze Reis die Eisenaufnahmestrategie II nutzt, nutzen zweikeimblättrige Pflanzen eine andere Strategie (Strategie I)38. Wir haben daher getestet, ob HSAL auch die Bioverfügbarkeit von Eisen in der zweikeimblättrigen Modellpflanze Arabidopsis thaliana verbessern kann. Hierzu verwendeten wir ein Agarmedium mit der Hälfte von Murashige und Skoog (MS)-Salz. Unsere Behandlung mit 0,05 % HSAL erhöhte den Chlorophyllgehalt (1,31-fach, p < 0,05) und die Wurzellänge (3,08-fach, p < 0,05) von Arabidopsis unter Eisenmangelbedingungen signifikant (Abb. 5a–c). Darüber hinaus stellten wir fest, dass 0,05 % HSAL auch die Mangelphänotypen anderer Metallnährstoffe wie Kalzium und Magnesium linderten, obwohl der Erholungseffekt weniger ausgeprägt war als der von Eisenmangel (ergänzende Abbildung 8). Wie bei Reis wurde auch bei Arabidopsis ein Anstieg der Nährstoffanreicherung wie Eisen, Kalzium, Magnesium und Zink um 0,05 % HSAL-Behandlung festgestellt (ergänzende Abbildung 9). Unter dieser Wachstumsbedingung betrug die Konzentration von Eisen, Kalzium, Magnesium und Zink, die in 0,05 % HSAL enthalten waren, nur 0,06 %, 0,01 %, 0,01 % und 0,01 % der entsprechenden Elemente im Halb-MS-Medium (Ergänzungstabelle 2). Sie waren auch für die Nährstoffaufnahme durch Arabidopsis vernachlässigbar. Konsistenterweise wurde der Eisengehalt von Arabidopsis, der bei HSAL-Behandlung unter Eisenmangelbedingungen anstieg, auch nicht von HSAL-haltigem Eisen abgeleitet (Ergänzungstabelle 4). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass HSAL ein wirksamer Chelator zur Verbesserung der Eisenbioverfügbarkeit und Eisenakkumulation in Arabidopsis thaliana sein kann.

a Repräsentative Bilder, die die Wirkung von 0,05 % HSAL auf die Wiederherstellung des Eisenmangel-Phänotyps in verschiedenen Arabidopsis-Mutanten mit Eisenaufnahmemangel zeigen. Sämlinge von Wildtyp Col-0 und den Mutanten opt3-2, irt1−1 und fro2 wurden 10 Tage lang unter ½ MS-Medium (+Fe) und Eisenmangelmedium (-Fe) gezüchtet. b Gesamtchlorophyllgehalt. Die Diagramme zeigen den Mittelwert mit Standardabweichung (Fehlerbalken) und einzelne Datenpunkte (n = 3 biologisch unabhängige Replikate). c Boxplots und Streudiagramme, die die Wurzellänge zeigen. Kästchen stellen den Bereich des 25.–75. Perzentils dar, weiße Linien stellen Mediane dar und Whiskers zeigen den Bereich zwischen Minimum und Maximum. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf statistisch signifikante Unterschiede basierend auf der einfaktoriellen ANOVA- und Tukey-HSD-Testanalyse (p < 0,05) in b–e hin. Wirkung unterschiedlicher Konzentrationen von EDTA-Na2 (0–1300 μM) auf die Wiederherstellung von Eisenmangel-Phänotypen in Wild- Typ Arabidopsis und verschiedene Eisenaufnahme- und -transportdefekte Mutanten (opt3-2, irt1−1 und fro2). Die Sämlinge wurden 9 Tage lang auf einem Medium mit Eisenmangel (½ MS mit 50 μM EDTA-Fe (III), pH = 5,7) oder einem Medium mit Eisenmangel (½ MS ohne EDTA-Fe (III), pH = 5,7) gezüchtet. Gesamtchlorophyllgehalt bei Eisenmangel d und Eisenmangelbedingungen e. N = 4 biologisch unabhängige Replikate. f, g Wurzellänge unter Eisenmangel f und Eisen ausreichend Bedingungen g. Die Linien geben den Mittelwert und die Standardabweichung an (Fehlerbalken). N = 15 Setzlinge. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Genotypen d–g hin, basierend auf der einfaktoriellen ANOVA und der HSD-Testanalyse von Tukey (p < 0,05).

Verschiedene Chelatoren können die Eisenaufnahme von der Wurzeloberfläche zum Gefäßgewebe und die anschließende Translokation zum Spross verbessern39. Um die Aufnahmewege für HSAL-chelatisiertes Eisen in Pflanzen zu untersuchen, haben wir getestet, ob HSAL den Eisenmangel in Arabidopsis-Mutanten lindert, bei denen die Eisenaufnahme beeinträchtigt ist (Abb. 5a). Dazu gehörten eine Phloem-spezifische Eisentransporter-Mutante opt3-240, eine Plasmamembran-Eisentransporter-Mutante irt1-141 und eine Eisenchelat-Reduktase-Mutante fro242. Wir fanden heraus, dass 0,05 % HSAL den Chlorophyllgehalt und die Wurzellänge von opt3-2 signifikant auf das Wildtyp-Niveau wiederherstellten, während es die von irt1-1 und fro2 nicht wiederherstellte (Abb. 5b, c). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die FRO2- und IRT1-vermittelte Eisenaufnahme für die Aufnahme von HSAL-chelatisiertem Eisen in die Pflanze wesentlich ist. Das in der Plasmamembran lokalisierte FRO2 reduziert extrazelluläres Eisenchelat zu Eisen42, das dann von IRT1 über die Plasmamembran in die Zellen transportiert wird41. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass HSAL ein Eisen-Eisen-Chelator ist. Anschließend verglichen wir die Wirkung des bekannten Eisenchelators EDTA mit der durch HSAL verliehenen Wirkung in allen diesen Arabidopsis-Mutantenlinien (opt3-2, irt1-1 und fro2). Das Erholungsmuster von EDTA bei Eisenmangel-Phänotypen in diesen Mutanten mit Eisenaufnahmemangel war dem von HSAL sehr ähnlich (Abb. 5d – g und ergänzende Abb. 10). Dieses Ergebnis stützte weiter das Modell, dass HSAL wie EDTA als Eisen(III)-Eisen-Chelator dienen kann, um die Bioverfügbarkeit von Eisen zu verbessern und das Pflanzenwachstum unter Eisenmangelbedingungen zu retten.

Natürliches Lignin ist ein komplexes phenolisches organisches Makromolekül, das aus Phenylpropaneinheiten besteht, die hauptsächlich durch Kohlenstoff-Sauerstoff-Kohlenstoff-Bindungen und Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen verbunden sind, deren Aufbrechen hohe Energie erfordert43. Während des Prozesses der Bioraffinerie kann Lignin durch die Bildung neuer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen weiter kondensiert werden44. SAL stellt eine wichtige Art von industriellem Lignin dar, das in Bioraffinerien hergestellt wird und zu den am stärksten kondensierten Ligninen zählt22. Mithilfe einer einfachen hydrothermischen alkalischen Reaktion haben wir die Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen und Kohlenstoff-Sauerstoff-Kohlenstoff-Bindungen des kondensierten Lignins abgeschert und SAL in das wasserlösliche HSAL22 umgewandelt. In dieser Studie fanden wir eine starke Reduzierung der Methoxygruppen und eine Zunahme der phenolischen Hydroxylgruppen in HSAL und charakterisierten seine metallchelatbildenden Eigenschaften. Wichtig ist, dass wir gezeigt haben, dass HSAL als nachhaltiger Nährstoff-Chelator fungiert, um die Bioverfügbarkeit und das Wachstum pflanzlicher Metallnährstoffe zu fördern. Obwohl seit langem bekannt ist, dass eine alkalische Behandlung (bei unterschiedlichen Alkalitätsniveaus, Temperaturen und Druckbedingungen) Lignin auflösen kann44, hat keine frühere Forschung diese Art von gelöstem Lignin unter säurealkalischen Bedingungen zur Förderung des Pflanzenwachstums genutzt. HSAL kann das Wurzelwachstum erheblich fördern und eine deutlich erhöhte Wurzel- und Sprossbiomasse sowohl bei einkeimblättrigen als auch zweikeimblättrigen Pflanzen ermöglichen, indem es die Bioverfügbarkeit von Eisen und auch anderen Metallnährstoffen verbessert. HSAL verbessert die Bioverfügbarkeit von Eisen entsprechend dem bekannten Metallchelatbildner EDTA. Beide Chelatoren benötigen die FRO2-Eisenreduktase-Aktivität und den IRT1-Transporter, um die Reduktion von Eisen (III) zu erleichtern und den Eintritt von Eisen (II) in Pflanzenzellen zu vermitteln. Aufgrund ihrer nicht biologisch abbaubaren Natur reichern sich synthetische Eisenchelatoren wie EDTA-Na2 und Ethydiaminedhephenessig-Na (EDDHA-Na) jedoch im Boden an und sind mit einer Reihe sekundärer Risiken wie einer Schwermetallüberladung verbunden Wasser und Pflanzen45,46,47. Im Gegensatz dazu wird HSAL wahrscheinlich ähnlich wie die strukturell verwandten Huminstoffe in Böden abgebaut48. Zahlreiche Studien haben auch gezeigt, dass das Pflanzenwachstum andere aus der Industrie stammende Ligninmaterialien wie Ligninsulfonate, die als Nebenprodukt bei der Herstellung von Papierzellstoff durch den Sulfitprozess entstehen, und Nanopartikel auf Ligninbasis fördern, obwohl die Mechanismen, die diesem zugrunde liegen, nicht gut untersucht sind49. 50. Daher stellt HSAL einen neuartigen Metallchelatbildner dar, der zu geringeren Kosten und auf nachhaltige Weise hergestellt werden kann, da er Treibhausgasemissionen aus der Verbrennung von Abfalllignin verhindert. Es ist daher eine vielversprechende Verbindung, um in Zukunft synthetische Chelatbildner zu ersetzen.

Wie im Modell der HSAL-Funktion zur Verbesserung des Pflanzenwachstums in Abb. 6 gezeigt, schlagen wir zwei Hauptschritte für HSAL vor, um die Bioverfügbarkeit von Eisen durch die Fähigkeit zur Metallchelatisierung zu erhöhen. Erstens könnte HSAL Eisen (III) im Medium chelatisieren, um die Eisenmobilität zu verbessern, was die Eisendiffusion in den apoplastischen Wurzelraum erhöht und somit die Bioverfügbarkeit von Eisen verbessert. Zweitens könnte HSAL apoplastisches Eisen (III) chelatisieren, um die Ausfällung von Eisen in Zellwänden zu verhindern und so die Bioverfügbarkeit von Eisen zu verbessern. Der letztgenannte Mechanismus wird durch das Ergebnis gestützt, dass der HSAL-abhängige Eiseneintritt in Pflanzenzellen die FRO2-Eisenreduktase-Aktivität und den Eisen-IRT1-Transporter in der nicht-grasigen Pflanze Arabidopsis der Strategie I erfordert. In Strategie-II-Pflanzen wie Reis nehmen die Wurzeln Eisen in Form von Phytosiderophor-chelatisierten Eisen(III)-Eisen-Komplexen auf. Wir glauben jedoch nicht, dass mit HSAL chelatisiertes Eisen (III) direkt in Pflanzenzellen gelangt, da das Molekulargewicht von HSAL höher als 3500 ist (wir hatten HSAL mit einem Zelluloseröhrchen mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 3500 gesammelt) und natürliche, aus Lignin gewonnene Substanzen mit Es wurde vermutet, dass ein Anteil mit hoher Molekülgröße (Mw > 3500) nicht direkt von den Wurzeln absorbiert wird51. Alternativ könnte Eisen (III) aus HSAL-Chelatkomplexen freigesetzt und in Form von Phytosiderophor-Chelatkomplexen in Wurzelzellen transportiert werden.

Schwefelsäurelignin (SAL) wird durch eine hydrothermale Reaktion in ein wasserlösliches Material auf Ligninbasis (HSAL) umgewandelt. Diese Reaktion zerreißt nicht nur die Bindungen der Monomere, um das Lignin zu depolymerisieren, sondern führt auch zu einer Abnahme der Methoxygruppen und einer Zunahme der phenolischen Hydroxylgruppen. Aufgrund dieser veränderten Struktur fungiert HSAL als nachhaltiger Eisen-Eisen-Chelator, der das Pflanzenwachstum und die Wurzellänge fördert, indem es Eisen-III chelatisiert, um die Bioverfügbarkeit von Eisen im Wachstumsmedium und im apoplastischen Raum sowohl bei Reis als auch bei Arabidopsis zu verbessern. In der Strategie-I-Pflanze Arabidopsis wird HSAL-chelatiertes Eisen(III)-Eisen durch die FRO2-Eisen-Reduktase zu Eisen(II)-Eisen reduziert und dann über den IRT1-Transporter in die Pflanzenzellen transportiert. Im Pflanzenreis der Strategie II könnte Eisen (III) aus HSAL-Chelatkomplexen freigesetzt und über YSL-Transporter in Form von Phytosiderophor-Chelatkomplexen in Wurzelzellen transportiert werden.

Die Anwendung von HSAL rettete auch den Wachstumsdefekt von Arabidopsis thaliana, der durch den Mangel an verschiedenen Nährstoffen, einschließlich Ca, Mg, Zn und Cu, verursacht wurde (ergänzende Abbildung 8), und erhöhte auch die Gesamtmengen dieser Metallnährstoffe, insbesondere Ca, in Pflanzengeweben (Ergänzende Abbildung 9). Diese Ergebnisse deuten daher darauf hin, dass die Funktion von HSAL nicht spezifisch für Eisen ist, was mit der Metallchelatbildungskapazität von HSAL übereinstimmt. Wir gehen davon aus, dass HSAL höchstwahrscheinlich die Beweglichkeit dieser Ionen im Wachstumsmedium verbessert, um die Diffusion von Metallnährstoffen zur Wurzeloberfläche zu erhöhen und/oder durch seine Chelatbildungskapazität die Ausfällung von Eisen in Zellwänden zu verhindern, was zu einer erhöhten Bioverfügbarkeit dieser Metallnährstoffe für Pflanzen führt .

Erstens sind die Bedingungen und Kosten für die HSAL-Produktion relativ einfach und niedrig. HSAL ist ein mittelgroßes Ligninmaterial (ca. 7,5 KD), das aus dem im Labor hergestellten SAL durch eine alkalische (NaOH-Lösung) hydrothermale Reaktion bei 280 °C für 2 Stunden umgewandelt wird. Wenn das Abfall-Lignin-SAL, das in der Biomasseraffinierungsindustrie anfällt, für die HSAL-Produktion verwendet wird, kann dies die Kosten erhöhen, da zusätzliche Verfahren wie die Reinigung und Isolierung der ursprünglichen Industrieabfälle erforderlich sind, aber es könnte die Menge der anschließenden NaOH-Lösung aufgrund reduzieren zusätzlicher Säure-Base-Neutralisationsverbrauch. Die Kosten der HSAL-Produktion wurden basierend auf der Laborumrechnung auf etwa 329–430 USD pro Tonne berechnet und können durch die großtechnische Industrieproduktion weiter auf 139–213 USD pro Tonne gesenkt werden (Einzelheiten siehe Abschnitt „Methoden“). Dieser Preis liegt weit unter 3.500–350.000 USD pro Tonne für synthetische Metallchelatbildner wie EDTA, EDDHA und DTPA52. Auch die Kosten für die HSAL-Produktion liegen deutlich unter 495–850 USD pro Tonne für Ligninsulfonat53. Der Produktionsprozess und die Kosten für Lignin-basierte Nanopartikel sind komplizierter und höher54. Zweitens besteht möglicherweise ein sehr hoher Bedarf an HSAL-Produktion, um die Metallnährstoffe und das Wachstum wichtiger Grundnahrungsmittel zu steigern. Beispielsweise handelt es sich bei einem Drittel (rund 0,52 Milliarden Hektar) der weltweiten Ackerfläche um eisenarme Böden55, die eine große Menge an eisenchelatbildenden Düngemittelzusätzen erfordern, um den Ertrag und die Qualität der Nutzpflanzen zu verbessern46. Auf diesem eisenarmen Ackerland könnten potenziell bis zu 17,9 Millionen Tonnen HSAL pro Jahr in einer Konzentration von 0,05 % ausgebracht werden55. Basierend auf der HSAL-Umwandlungsrate von 46,7 % (Abb. 1) wären 38,2 Millionen Tonnen Lignin erforderlich, was 76,6 % des gesamten Lignins (50 Millionen Tonnen) der Industrieabfälle verbrauchen würde, die im Jahr 2020 von der Lignozellulose-Bioraffinerieindustrie entsorgt werden1. Drittens reduziert der Einsatz von HSAL nicht nur die Kohlenstoffemissionen von Bioraffineriefabriken, sondern verspricht auch eine Erhöhung der Kohlenstoffspeicherung im Boden. Wenn das meiste industrielle Lignin in HSAL umgewandelt und auf eisenarmen Böden ausgebracht würde, würden 116,8 Millionen Tonnen CO2-Emissionen durch die Vermeidung der Verbrennung des Ausgangsmaterials reduziert56. Darüber hinaus könnte die Zunahme des Wurzelwachstums von Pflanzen die Kohlenstoffbindung im Boden verbessern57,58,59. Es wurden jedoch noch keine geeigneten Ansätze zur Verbesserung der Tiefe und Biomasse der Pflanzenwurzelsysteme entwickelt. Die positiven Auswirkungen von HSAL könnten einen vielversprechenden Beitrag zur Erreichung dieses Ziels darstellen.

Um hochreines Schwefelsäure-Lignin (SAL) zu erhalten, das das Lignin-Nebenprodukt aus der Lignozellulose-Bioraffinerie durch die Verwendung konzentrierter Schwefelsäure simuliert, haben wir die Klason-Methode verwendet, um Zellulose und andere Kohlenhydrate im Holzpulver mithilfe der Hydrolyse konzentrierter Schwefelsäure vollständig zu entfernen. Insgesamt 12,5 g Holzpulver (60–100 Mesh) japanischer Zeder (Cryptomeria japonica) wurden mit der Soxhlet-Lösung (Benzol/Ethanol = 2:1) extrahiert und anschließend einer Klason-Methode (TAPPI Standard T-222, 2006) angewendet )22. Kurz gesagt, wurde der Lösung 72 % konzentrierte Schwefelsäure zugesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert; Anschließend wurde die Schwefelsäure mit Wasser auf 3 % verdünnt und die Reaktion 90 Minuten lang in einem Ölbad bei 90 °C durchgeführt. Das resultierende unlösliche Substrat war SAL. Danach wurde eine Mischung aus 500 mg SAL, 500 mg NaOH und 15 ml Wasser in einem Edelstahlrohr mit einem Innenvolumen von 50 cm3 verschlossen und 2 Stunden lang auf 280 °C erhitzt. Nach der Reaktion wurde das Edelstahlrohr durch Eintauchen in ein Wasserbad sofort auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Reaktionsmischung wurde unter Verwendung eines 1G3-Filters (Sekiya, Tokio, Japan) filtriert, um die flüssige Form des hydrothermisch behandelten SAL (HSAL genannt) zu erhalten. Die HSAL-Lösung wurde sorgfältig gesammelt und unter Verwendung eines Zelluloseröhrchens mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 3500 (Tubing TM 3500; Bio-Design, Carmel, NY, USA) dialysiert, um anorganische Reagenzien zu entfernen. HSAL-Pulver wurde mithilfe eines Lyophilisierungsverfahrens gewonnen. Die Löslichkeit von HSAL wurde anhand der Menge bestimmt, die in 100 g Reinstwasser gelöst war, als es bei Raumtemperatur (25 °C) die Sättigung erreichte60.

Die Gesamtunterschiede in den funktionellen Gruppen von SAL und HSAL wurden durch spektroskopische Analyse mit Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FT-IR) unter Verwendung eines SHIMADZU8400s (Kyoto, Japan) im Bereich zwischen 400 und 4000 cm-1 mit einer Auflösung von 4 cm-1 bestimmt und 32 Scans. Jede Probe wurde mit der Kaliumbromid-Methode61 hergestellt. Der Methoxygehalt von SAL oder HSAL wurde mit einer modifizierten TAPPI-Methode (TAPPI Standard T209 su-72, 2016) gemessen. Kurz gesagt, 3 mg SAL oder HSAL reagierten mit Iodwasserstoffsäure (57 %, w/w) in einem verschlossenen Glasfläschchen bei 130 °C für 20 Minuten, um Methyliodid zu erzeugen. Der Methyliodidgehalt wurde mit einem Gaschromatographie-Flammenionisationsdetektor (GC-FID, GL Sciences, Tokio, Japan) mit einer TC-1-Kapillarsäule (60 m × 0,25 mm Innendurchmesser; GL Sciences) mit einem N2-Trägerfluss bestimmt. Der relative quantitative Vergleich des Methoxygehalts basierte auf der Bestimmung von SAL oder HSAL mit Methyliodid (in Tetrachlormethanlösung gelöstes Ethyliodid wurde als Standardlösung verwendet).

Die Gesamtmenge an freien Hydroxylgruppen in SAL oder HSAL wurde mithilfe der Acetylierungsmethode62 bestimmt. 0,2 g SAL oder HSAL reagierten mit dem Acetylierungsreagenz (enthaltend 1 ml Essigsäureanhydrid und 1 ml Pyridin) 48 Stunden lang bei 50 °C, dann wurden 2 ml Aceton und 2 ml Wasser zugegeben und dann wurde 0,01 M NaOH-Lösung verwendet Bestimmen Sie den Essigsäuregehalt durch potentiometrische Titration. Die gesamten freien Hydroxylgruppen wurden basierend auf dem Verbrauch von 0,01 M NaOH-Lösung berechnet. Die Verteilung der phenolischen Hydroxylgruppen und alkoholischen Hydroxylgruppen von HSAL wurde anhand der Menge an aliphatischen und phenolischen Acetatprotonen charakterisiert, die mithilfe von 1H-NMR-Spektren (Bruker AVANCE 400 MHz, Deutschland) von acetyliertem HSAL aufgezeichnet wurden. Die Quantifizierung der aliphatischen Acetate (1,6–2,1 ppm) und phenolischen Acetate (2,1 ppm bis 2,6 ppm) wurde durch Peakintegration im Vergleich zu Peaks des internen Standards von Dibrommethan (4,9 ppm) erreicht. Da SAL in organischen NMR-Reagenzien nahezu unlöslich zu sein scheint und mit NMR-Methoden schwer nachweisbar zu sein scheint, wurde der phenolische Hydroxylgehalt von SAL mithilfe der selektiven Ammonolysemethode62 bestimmt. Kurz gesagt, die Hydroxylgruppe von SAL wurde zunächst mit einem Acetylierungsreagens (enthaltend 1 ml Essigsäureanhydrid und 1 ml Pyridin) acetyliert und 48 Stunden lang unter Stickstoffschutz bei Raumtemperatur gerührt, dann wurde eine bekannte Menge interner Standard N-Propionylpyrrolidin (0,1 %) zugegeben M) wurde einer Pyrrolidinlösung zur Acetylgruppen-Ammonolyse zugesetzt. Die zu Beginn der Reaktion erzeugte Menge an N-Acetylpyrrolidin wurde durch eine Gaschromatographieanalyse (Shimadzu GCMS-QP 2010) bestimmt und zur Bestimmung des phenolischen Hydroxylgehalts von SAL verwendet. Die Menge an Methoxygruppen, phenolischen Hydroxylgruppen und alkoholischen Hydroxylgruppen pro 100 C9-Einheiten wurde auf der Grundlage der quantitativen Analyse dieser funktionellen Gruppen und des Polymerisationsgrads im Lignin berechnet, der aus dem durchschnittlichen Molekulargewicht von SAL oder HSAL umgerechnet wurde.

Um HSAL-Metall-Chelatkomplexe zu erhalten, wurden 0,2 g HSAL in 20 ml hochreinem Wasser gelöst und 0,1 M FeSO4 (15,19 g), FeCl3 (16,22 g) bzw. CaCl2 (11,09 g) zugegeben. Anschließend wurde 6 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Flüssigkeit wurde in die Zellulosemembran eingeleitet, 96 Stunden lang in Wasser gespült und gefriergetrocknet (FM25EL, SP Industries, USA), um die verschiedenen HSAL-Chelatkomplexe zu sammeln. Die Elementzusammensetzung und der Elementvalenzzustand von HSAL und seinen Chelatkomplexen wurden mit einem Röntgenphotoelektronenspektrometer (XPS, ESCALAB MARK II, VG Instruments, UK) mit monochromatisiertem Al Kα (hυ = 1253,6 eV) analysiert. Das Spektrometer wurde anhand der Bindungsenergie (50,0 eV) von Au 4f7/2 in Bezug auf das Fermi-Niveau kalibriert. Die Proben wurden auf einem leitfähigen Kohlenstoffband befestigt, das in einem Probenhalter aus Kupfer gehalten wurde, und direkt in die Analysekammer überführt. Die XPS-Linien wurden anhand des C 1 s-Peaks bei 284,8 eV kalibriert, der an der Oberfläche aller Proben vorhanden war. Der Modellpeak zur Beschreibung von XPS-Kernlinien für die Kurvenanpassung war ein Produkt von Gauß- und Lorentz-Funktionen. Die funktionelle Gruppenanalyse verschiedener HSAL-Chelatkomplexe wurde mittels FT-IR-Spektroskopie (Vertex 70, Bruker, Deutschland) durchgeführt. Der Bereich zwischen 4000 cm-1 und 800 cm-1 wurde mit einer Auflösung von 4 cm-1 und 32 Scans unter Verwendung von KBr-Pellets61 erfasst.

Um zu testen, ob sich kristalline Hybridmaterialien in HSAL und mit FeCl3 chelatisiertem HSAL bilden, wurde eine Röntgenpulverbeugungsanalyse (XRPD) mit einem Escalab 250Xi-Diffraktometer (Thermo Fisher, UK) mit Cu-Kα-Strahlung durchgeführt, das mit einem Si(Li)-Festkörper ausgestattet war. Zustandsdetektor. Der aufgezeichnete Winkelbereich reichte von 5° bis 70° (2θ) mit einer Scanbreite von 0,05° in 2 s pro Schritt34. Das mit ATR-Zubehör (Diamant) ausgestattete Nicolet 5PCFT-IR-Spektrophotometer wurde für die Infrarotspektren im Bereich von 400–4000 cm–1 durchgeführt. Um die mikromorphologischen Unterschiede und die Elementkartierung von HSAL und mit FeCl3 chelatisiertem HSAL weiter zu beobachten, wurde ein Transmissionselektronenmikroskop (TEM) Tecnai G2 F20 S-TWIN (FEI, USA) bei 200 kV mit einem energiedispersiven Oxford X-MaxN 80 T X verwendet Der EDS-Detektor (-ray spectrometer) wurde zur Charakterisierung der Atomzusammensetzung an bestimmten Positionen35 verwendet. Die Proben wurden durch Mahlen der Pulver und Tropfengießen auf einen löchrigen Kohlenstofffilm hergestellt.

Um den Eisenchelatwert von HSAL und EDTA zu quantifizieren, wurden 0,1 g HSAL oder EDTA in 10 ml destilliertem Wasser mit einem Indikator (5 % Sulfosalicylsäure) gelöst und mit 0,01 M NH4Fe(SO4)2-Standardlösung titriert. Der Titrationsendpunkt wurde durch den Farbumschlag der Lösung von Gelb nach Hellrot angezeigt. Um den Calciumchelatwert von HSAL und EDTA zu bestimmen, wurden 0,1 g HSAL oder EDTA in 10 ml destilliertem Wasser gelöst und mit 1 ml Ammoniak-Ammoniumchlorid-Pufferlösung bestehend aus 1 M Ammoniumchlorid und 9,8 % Ammoniak bei pH 10 ergänzt , und einem Indikator (saures Germaniumblau K: Naphtholgrün B: Kaliumchlorid = 1:2:40) und dann mit 0,2 M Calciumacetatlösung titriert. Der Titrationsendpunkt wurde durch den Farbwechsel der Lösung von leuchtendem Blau zu Purpurrot angezeigt. Die Ca2+- und Fe3+-Chelatbildungswerte von HSAL und EDTA wurden basierend auf dem Titrationsverbrauch berechnet.

Sämlinge von drei verschiedenen Sorten Oryza sativa L. japonica-Reis (Nipponbare, Taichung 65 und Kasalath); In dieser Studie wurden Mais (Zea mays L.), Arabidopsis thaliana accession Columbia-0 (Col-0) und die Mutanten irt1-141, frd1-1 (fro2)42 und opt3-240 verwendet.

Reissamen wurden durch Einweichen in einer Benlate-Lösung (2,5 g L–1) und dreitägige Vernalisierung bei 28 °C sterilisiert. Diese Reissämlinge wurden in ein hydroponisches Wachstumssystem mit unterschiedlichen HSAL-Konzentrationen (0 %, 0,01 %, 0,05 % und 0,1 %) in gefiltertem Wasser ohne zusätzliche Nährstoffe in einer undurchsichtigen Plastikbox überführt und in einer Wachstumskammer (MLR351) gezüchtet , Sanyo, Japan) bei 28 °C Langtagbedingungen (16 h Licht 16000 Lux 28 °C/8 h Dunkelheit 25 °C) für 14 Tage. Bilder von Reissämlingen (n = 12) wurden mit einer Digitalkamera (D90, Nikon, Japan) aufgenommen. Die Wurzellänge und die Sprosslänge der Reiskeimlinge wurden mit einem Lineal gemessen. Zur Messung der Biomasse wurde das Trockengewicht des Pflanzengewebes verwendet.

Für Reis-Eisenmangel-Experimente wurden Reissamen zweimal für 10 Minuten in eine 10-prozentige Wasserstoffperoxidlösung (7722-84-1, SCR, China) getaucht und mit 10-prozentigem Natriumhypochlorit (7681-52-9, SCR, China) sterilisiert. 15 Minuten lang unter Rühren. Diese Reissämlinge wurden 3 Tage lang bei 28 °C vernalisiert, bevor sie in die eisenarme (ohne Zugabe von EDTA-Fe(II)) oder eisenreiche (36 µM EDTA-Fe(II)) IRRI-Hydrokulturlösung (hydroponische Nährlösung) überführt wurden basierend auf dem Rezept des International Rice Research Institute) mit oder ohne 0,05 % HSAL in einer undurchsichtigen Plastikbox und gezüchtet in einer Wachstumskammer (GXZ-500C-3, Jiangnan, China) unter Langzeitbedingungen (16 Stunden Licht 16000). Lux 28 °C/8 h dunkel 25 °C) für 10 Tage. Wurzellänge und Sprosslänge der Reiskeimlinge (n = 12) wurden mit einem Lineal gemessen. Wurzeln und Stängel wurden getrennt beprobt und für die anschließende Elementaranalyse getrocknet.

Maissamen (Zea mays L.) wurden durch Behandlung mit einer verdünnten H2O2-Lösung sterilisiert. Sterilisierte Samen wurden auf einem feuchten Filterpapier im Dunkeln bei 25 °C 4 Tage lang zum Keimen gebracht. Anschließend wurden Maissämlinge zum Wachsen in Erde überführt, die auf dem Higashiyama-Campus der Universität Nagoya (GPS-Koordinaten: 35°10'00.00“N, 136°55'00.00“E) gesammelt und in einer Wachstumskammer platziert wurde, die 8 Stunden lang Licht bei 16.000 Lux und 19° lieferte C/16 h dunkel 17 °C für 2 Wochen. Maissämlinge (n = 11) wurden mit gefiltertem Wasser (Kontrolle), 0,4 % Dünger (HYPONex, 250-fach verdünnt) (Düngemittelgruppe), 0,4 % HSAL (HSAL-Gruppe) oder einer Kombination aus 0,4 % Dünger und 0,4 % bewässert % HSAL (Dünger + HSAL-Gruppe), jeweils einmal (200 ml) alle 2 Tage. Nach 14 Tagen Pflanzzeit wurden die Wurzeln ausgegraben und mit Wasser abgespült. Die Wurzellänge wurde mit einem weichen Lineal gemessen und das Trockengewicht des Pflanzengewebes wurde gemessen, um die Biomasse zu ermitteln.

Arabidopsis-Samen wurden mit 1 % Natriumhypochlorit-Desinfektionsmittel oberflächensterilisiert und 2 Tage lang bei 4 °C vernalisiert. Diese Samen wurden dann auf die Platten gesät, die ½ Murashige- und Skoog-Salz (MS) mit 1 % Agar enthielten. Die Platten wurden vertikal in eine Wachstumskammer (GXZ-380C-4, Jiangnan, China) bei 22 °C mit 16-stündigen Licht-/8-stündigen Dunkelzyklen gestellt. Für die HSAL-Behandlung wurde eine Konzentration von 0,05 % (m/m) HSAL zu ½ MS-Medium hinzugefügt. Für Nährstoffmangelexperimente wurde der entsprechende Nährstoff, wie in den Abbildungen angegeben, aus dem ½ MS-Salz entfernt. Für die EDTA-Behandlung wurden unterschiedliche Konzentrationen von EDTA-Na2, wie in der Abbildung angegeben, dem ½ MS-Medium mit oder ohne Eisenmangel zugesetzt. Die Bilder der Sämlinge (n = 12) wurden mit einer Kamera (Nikon, D5600, Japan) nach 10-tägigem Wachstum aufgenommen. Die Wurzellänge wurde mit Image J (https://imagej.net/imagej-wiki-static/Fiji) analysiert.

Reissämlinge wurden 7 Tage lang in Wasser mit oder ohne 0,05 % HSAL gezüchtet. Die Hauptwurzelsegmente (1,5 mm bis 8,5 mm von der Wurzelspitze entfernt) dieser Sämlinge wurden gesammelt und unter Verwendung von 30 %, 50 %, 70 %, 95 % und 100 % Ethanol in jedem Schritt 30 Minuten lang dehydriert. 100 % Ethanol wurde zweimal gewechselt und das Gewebe über Nacht bei 4 °C gelagert und in Epoxidharz (EPON812; TAAB, Berkshire, UK) eingebettet. Für die Kryo-SEM-Beobachtung wurden mit einem Glasmesser auf einem Ultramikrotom (Ultracut N; Reichert, Wien, Österreich) Querschnitte von etwa 1 µm Dicke geschnitten. Die gefrorene Probe wurde in einem Probenhalter fixiert, in der Glovebox (unter –30 °C) unter trockener N2-Atmosphäre geschnitten und in das Kryo-Rasterelektronenmikroskop (Cryo-SEM, S-3400N-T3, Hitachi, Tokio, Japan) durch Kryo-Vakuum-Transfer-Shuttles (TRIFT III, ULVAC-PHI Inc., Kanagawa, Japan). Die Zellmorphologie wurde mit Cryo-SEM63 beobachtet.

Reissämlinge wurden 5 Tage lang in Wasser kultiviert und dann 1,5 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 72 h und 192 h lang in 0,05 % HSAL-Lösung in der Wachstumskammer überführt. Die EdU-Fluoreszenzfärbung wurde verwendet, um die Zellproliferation in der Wurzelspitze anzuzeigen64. Die EdU-Färbung (ThermoFisher, A10044) wurde gemäß den Protokollen des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, Reissämlinge wurden 2 Stunden lang in 5 μM EdU eingetaucht. Die Wurzelspitze bis zu 5 mm dieser EdU-gefärbten Wurzeln wurde abgeschnitten und mit 4 % FAA fixiert und 10 Minuten lang vakuuminfiltriert. Nach der Sättigung der Membran und der Reaktion mit dem Reaktionscocktail wurden die Proben 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit DAPI gefärbt. Die EdU-Fluoreszenz für jede Wurzelprobe wurde mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (FV1200, Olympus, Japan) bei 454 nm nach Dehydratisierung durch abgestufte Konzentrationen von Ethanol und MES (Methylsalicylat) beobachtet.

Reissämlinge (Oryza sativa L. Nipponbare) wurden 7 Tage lang in Wasser kultiviert. Wurzelspitzen (ca. 5 mm) von Reiskeimlingen (28 Wurzelspitzen pro Gruppe) mit oder ohne HSAL-Behandlung für 12 Stunden. Wir extrahierten die Gesamt-RNA der Wurzelspitzen mit dem TRIzol-Reagenz (Invitrogen) und folgten dabei den Anweisungen des Herstellers. Die Gesamt-RNA wurde einer Bibliotheksvorbereitung mit dem Truseq-Strang-mRNA-Sequenzierungskit (Illumina Inc.) unterzogen und anschließend einer Single-End-Sequenzierung mit der Illumina Novaseq 6000-Plattform unterzogen. Die Rohlesevorgänge wurden gefiltert, um Lesevorgänge hoher Qualität ohne Adaptersequenzen und Lesevorgänge geringer Qualität (mit mehr als 10 % N oder abgeschnittene Enden von Lesevorgängen mit geringer Sequenzierungsqualität (

Reissämlinge (Oryza sativa L. Nipponbare) wurden 7 Tage lang in Wasser kultiviert. Zur RNA-Isolierung wurden die Wurzelspitzen (ca. 5 mm) von Reissämlingen (12 Wurzelspitzen als Gruppe) mit oder ohne HSAL-Behandlung für 12 Stunden gesammelt. Für jede Behandlung wurden sechs biologische Replikate analysiert. Die gesamte mRNA der Wurzelspitzen wurde mit dem FastPure Plant Total RNA Isolation Kit (Code-Nr. RC401-01, Vazyme, China) extrahiert. Insgesamt 150 ng RNA wurden zur Synthese der Erststrang-cDNA mit HiScript II Q Select RT SuperMix für qRT-PCR (+gDNA Wiper) (Code-Nr. R223-01, Vazyme, China) verwendet. Zur Herstellung des Reaktionsgemisches wurde Pro Universal SYBR qPCR Master Mix (Code-Nr. Q712-02, Vazyme, China) verwendet. Die PCR wurde auf einem StepOnePlus Real-Time PCR-System (Code-Nr. 4376600, Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA) durchgeführt. Die Primer für die qRT-PCR wurden in den Zusatzdaten 2 (Sangon Biotech, China) aufgeführt. Die Spezifität der Primer wurde durch Schmelzkurvenanalyse bestätigt. Als interne Referenz wurde eLF-4α verwendet.

Ungefähr 20 mg frische Blätter von 10 Tage alten Arabidopsis-Sämlingen wurden mit flüssigem Stickstoff eingefroren und zermahlen (Scientz-48 Touch Display High Throughput Tissuelyser, Ningbo, China) mit Stahlkügelchen in 2-ml-Röhrchen, dann wurden 1,8 ml Extraktionspuffer hinzugefügt hinzugefügt (Ethanol: Aceton: Wasser = 4,5:4,5:1; v/v) und im Dunkeln bei Raumtemperatur 15 Minuten lang geschüttelt (Orbitalschüttler TS-3D, Kylin-Bell, China). 1 ml Überstand wurde zur Messung des Chlorophyllgehalts nach 30-sekündiger Zentrifugation der Proben bei 6000 U/min verwendet. Die Absorption von Chlorophyll wurde bei den Wellenlängen 645 nm und 663 nm mit einem Ultraviolett-Spektrophotometer (The SpectraMax® i3x Multi-Mode Microplate Reader, Molecular Devices, LLC.) gemessen. Der Gesamtchlorophyllgehalt wurde mit der Formel berechnet: (20,29*A645 + 8,05*A663) *v/w*100068.

HSAL-Pulver (20 mg) wurde mit 4 ml HNO3 und 2 ml H2O2 unter Verwendung eines Mikrowellenaufschlusssystems (MARS6, CEM Microwave Technology Ltd., USA) aufgeschlossen, bis die Flüssigkeit klar und transparent war. Dies wurde mit hochreinem Wasser auf ein Endvolumen von 10 ml verdünnt. Der Gehalt an K, Ca, Mg, Fe, Cu und Zn in der Aufschlussflüssigkeit wurde mittels induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS Nexion300xx, Perkin Elmer, Inc., USA) nachgewiesen. Die 10 Tage alten Sämlinge von Arabidopsis thaliana und Reis (Oryza sativa L. japonica. Nipponbare) wurden mit der Reinigungslösung (10 mM EDTA-Na2) 30 Minuten lang gewaschen und anschließend mit hochreinem Wasser gespült und dann in Wurzeln und Triebe aufgeteilt . Die Proben wurden 48 Stunden lang bei 70 °C getrocknet und gewogen. Die getrockneten Proben wurden mit 2 ml konzentrierter HNO3 bei hoher Temperatur (maximal 220 °C für Arabidopsis thaliana und 280 °C für Reis) inkubiert, bis die Flüssigkeit klar und transparent war. Anschließend wurden die Proben mit Reinstwasser auf ein Endvolumen von 10 ml verdünnt. Der Gehalt an Ca, Mg, Fe, Cu und Zn in der Aufschlussflüssigkeit wurde mit einem Mikrowellen-Plasma-Atom-Emissionsspektrometer (4210-MP-AES; Agilent Technologies, USA) nachgewiesen.

Die Kostenberechnung der HSAL-Umwandlung basierte auf den aktuellen Versuchsbedingungen: 3 % SAL (auf Wasserbasis), behandelt mit der gleichen Masse NaOH bei 280 °C für 2 Stunden, und die Ausbeute an SAL, die durch hydrothermale Reaktion in HSAL umgewandelt wurde, beträgt 46,7 %. . Dementsprechend wurden die täglichen Produktionskosten69 einer Tonne HSAL unter Berücksichtigung des Energieverbrauchs der entsprechenden hydrothermalen SAL-NaOH-Mischflüssigkeit (spezifische Wärmekapazität von 3 % NaOH (c): 0,95 kcal. (kg °C)−1) ermittelt Behandlung (umgerechnet in Standardkohleäquivalent (2,93 × 104 kJ kg−1), 107–122 USD pro Tonne70) und der durch die NaOH-Zugabe verursachte Materialverbrauch (Recycling, berechnet bei jeweils 10 % Verlust, 300–600 USD pro Tonne ( Dadao Chemicals Co., Ltd.)). Im Szenario einer industriellen Großproduktion würde die Additivkonzentration von SAL auf 10 % erhöht (spezifische Wärmekapazität von 10 % NaOH (c): 0,89 kcal. (kg °C)−1), um die Produktionseffizienz weiter zu verbessern und Kosten senken. Unter der Voraussetzung, dass die Behandlungsbedingungen der hydrothermischen Reaktion konsistent sind, wurden die täglichen Produktionskosten einer Tonne HSAL berechnet.

c(SAL-NaOH): Spezifische Wärmekapazität der entsprechenden SAL-NaOH-Mischflüssigkeit;

m(SAL-NaOH): Gesamtmasse der entsprechenden SAL-NaOH-Mischflüssigkeit;

T2: Zieltemperatur der hydrothermischen Reaktion (°C);

T1: Starttemperatur der hydrothermischen Reaktion (°C);

Q (Std.Coal): Brennwert von Standardkohle (2,93 × 104 kJ kg−1);

P (Std.Coal): Durchschnittlicher Marktpreis für Standardkohle;

m (SAL): Masse des investierten SAL (hier angenommen als 1 Tonne);

P (NaOH): Durchschnittlicher Marktpreis von NaOH;

Ausbeute an HSAL: Ausbeute an durch hydrothermale Umwandlung erzeugtem HSAL (berechnet mit einer Laborausbeute von 46,7 %).

Alle Werte wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) und Boxplots dargestellt. Die Experimente wurden mindestens für drei biologische Replikate durchgeführt (die Anzahl der Proben für jeden Wert wurde in Abbildungen oder Abbildungslegenden angegeben) und zweimal wiederholt. Bei Boxplots stellen Kästchen den Bereich vom 25.–75. Perzentil dar, weiße Linien stellen Mediane dar und Whiskers zeigen den Bereich zwischen Minimum und Maximum. Statistische Analysen zwischen Gruppen wurden mit dem Student-t-Test (p < 0,05) unter Verwendung von GraphPad Prism 9 (GraphPad Software) für Windows analysiert. Signifikante Unterschiede bei Mehrfachvergleichen für Einzelpunktexperimente wurden durch einfaktorielle oder zweifaktorielle ANOVA mit dem Tukey-HSD-Test ermittelt, wie in den Legenden der Abbildungen angegeben. Alle in dieser Studie verwendeten statistischen Tests waren zweiseitig.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Daten, die diese Studie stützen, sind im Papier und in den Zusatzinformationsdateien verfügbar. Die Daten, die den Abbildungen 1b-f, 2b-f, 3b-g, 3i-l, 4b-d, 4f-i, 5b-g und den ergänzenden Abbildungen zugrunde liegen. 2a, 3b-g, 4b-g, 4b-d, 5b-d, 5f-g, 6a-d, 7a-h, 9a-h sowie die in dieser Studie erstellten Ergänzungstabellen 1–4 sind im bereitgestellt Quelldatendatei. Die in dieser Studie verwendeten rohen RNA-seq-Datensätze von Oryza sativa sind in der GEO-Datenbank unter dem Zugangscode GSE224234 verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Alle in dieser Studie verwendeten Codes sind bei Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7912947)71 frei verfügbar.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Xuhai Zhu (Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences), Xiao Jiang (North Carolina State University) und anderen Mitgliedern des Li-Labors und des Matsushita-Labors für wertvolle Diskussionen und Kommentare; Guoqing Zhu (Zentrum für Elektronenmikroskopie, Zhejiang-Universität) für Unterstützung bei der TEM-Analyse; Lijuan Mao (Analysezentrum für Agrarbiologie und Umweltwissenschaften, Fakultät für Agrar-, Lebens- und Umweltwissenschaften, Zhejiang-Universität) für FT-IR-Analyse; Jianli Shen (Experimental Center of Materials Science and Engineering, Zhejiang University) für XPRD-Analyse; Hanjie Zhang (Institut für Physik der kondensierten Materie der Universität Zhejiang) für die XPS-Analyse. Diese Arbeit wird unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 32172656 und U21A20234, an BL), der Natural Science Foundation der Provinz Zhejiang (Nr. LZ22C020002, an BL), den Fundamental Research Funds for the Central Universities (226- 2022-00084, an BL), der Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (Fördernummer 18H03959, an YM) und der Emachu-Stiftung (an YM).

MOE Key Laboratory of Environment Remediation and Ecological Health, College of Environmental and Resource Science, Zhejiang University, Hangzhou, Zhejiang, China

Qiang Liu, Zhihang Feng, Yihui Xiao, Xianyong Lin und Baohai Li

Graduiertenschule für Bioagrarwissenschaften, Universität Nagoya, Nagoya, Japan

Qiang Liu, Tsubasa Kawai, Dan Aoki, Kazuhiko Fukushima und Yasuyuki Matsushita

Internationales Zentrum für Forschung und Bildung in der Landwirtschaft, Universität Nagoya, Nagoya, Japan

Yoshiaki Inukai

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Weiming Shi

Staatliches Schlüssellabor für Boden und nachhaltige Landwirtschaft, Institut für Bodenkunde, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Nanjing, China

Weiming Shi

Labor für Pflanzenmolekular- und Zellbiologie, Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, CA, USA

Wolfgang Busch

Institut für Landwirtschaft, Universität für Landwirtschaft und Technologie Tokio, Fuchu-shi, Tokio, Japan

Yasuyuki Matsushita

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QL, YI, YM und BL konzipierten und gestalteten die Projekte. QL, YM, TK und DA führten die Experimente durch, QL, TK, YI, DA, ZF, YX, YM und BL analysierten die Daten. YI, KF, XL, YM und BL steuerten Materialien und Werkzeuge bei. QL, WS, WB, YM und BL haben den Artikel mit Beiträgen aller Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Yasuyuki Matsushita oder Baohai Li.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Xin-Yuan Huang, Paolo Pelagatti und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Liu, Q., Kawai, T., Inukai, Y. et al. Ein aus Lignin gewonnenes Material verbessert die Bioverfügbarkeit und das Wachstum von Pflanzennährstoffen durch seine Fähigkeit zur Metallchelatbildung. Nat Commun 14, 4866 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40497-2

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Eingegangen: 17. Januar 2023

Angenommen: 31. Juli 2023

Veröffentlicht: 11. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40497-2

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