Synthetische Xanthon-Derivate mit hoher anticandidaler Aktivität und positiven mykostatischen Selektivitätsindexwerten

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 11893 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Angesichts der aktuellen massiven Zunahme arzneimittelresistenter mikrobieller Infektionen sowie der bedeutenden Rolle von Pilzinfektionen bei der Zahl der Todesopfer bei COVID-19 ist die Entdeckung neuer Antimykotika äußerst wichtig. Natürliche und synthetische Xanthone sind vielversprechende Derivate, obwohl nur wenige Berichte ihren antimykotischen Wirkungsmechanismus im Detail aufgezeigt haben. Das von uns neu synthetisierte Xanthon-Derivat 44 zeigte eine starke antimykotische Aktivität gegen Referenz- und Fluconazol-resistente C. albicans-Stämme. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die aktivsten Verbindungen 42 und 44 keine Substrate für pilzliche ABC-Transporter (Cdr1p und Cdr2p) und Mdr1p sind, den Hauptvertreter der Effluxpumpen der Hauptförderer-Superfamilie, Membranproteine, die für die Entwicklung von Resistenzen verantwortlich sind. Darüber hinaus verringert die fungizide Wirkungsweise die Wahrscheinlichkeit anhaltender oder wiederkehrender Infektionen und der Entwicklung von Resistenzen. Vor diesem Hintergrund ist die nachgewiesene Tötungsaktivität der untersuchten Derivate zweifellos ihr Vorteil. Neu synthetisierte Verbindungen zeigten eine moderate Zytotoxizität gegenüber menschlichen Zelllinien, obwohl der Wert des Selektivitätsindex für humanpathogene Stämme günstig blieb. Unsere Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass die neuen synthetisierten Verbindungen 42 und 44 mit antimykotischer Aktivität auf die Hefe-Topoisomerase-II-Aktivität abzielen. Zusammenfassend ist eine weitere Validierung der Anwendbarkeit von Xanthonen als Antimykotika äußerst wertvoll.

Pilzmikroorganismen sind ätiologische Faktoren schwerer, oft tödlicher Infektionskrankheiten, insbesondere bei immungeschwächten Patienten. Die Zahl dieser Patienten nimmt rasant zu, nicht nur aufgrund von Krankheiten, die zu einer Immunschwäche führen, wie AIDS, sondern auch als Folge der häufigen Anwendung von Therapien, die das menschliche Immunabwehrsystem beeinträchtigen (Egantic-Krebstherapie mit Zytostatika, Steroidtherapie, Einsatz von Immunsuppressiva bei Transplantationspatienten). Systemische Mykosen werden bei diesen Patienten hauptsächlich durch hefeartige Mikroorganismen der Gattung Candida, insbesondere Candida albicans und Candida glabrata, sowie Fadenpilze der Gattung Aspergillus1 verursacht. Andererseits gelten viele Pilzmikroorganismen als eine der häufigsten Ursachen nosokomialer Infektionen. C. albicans gilt weltweit als vierthäufigster Erreger nosokomialer Infektionen. Darüber hinaus sind Chemotherapeutika, die in der klinischen Behandlung eingesetzt werden, zu Faktoren geworden, die die Selektion resistenter Zellen stimulieren. Ein neu beschriebener Krankheitserreger, Candida auris, ist ein aufkommender multiresistenter Organismus, der eine globale Bedrohung darstellt2. Darüber hinaus erschweren invasive Pilzinfektionen den klinischen Verlauf von COVID-19 und gehen mit einem deutlichen Anstieg der Mortalität einher, insbesondere bei kritisch kranken Patienten, die auf einer Intensivstation aufgenommen werden3. Angesichts der aktuellen massiven Zunahme arzneimittelresistenter mikrobieller Infektionen sowie der bedeutenden Rolle von Pilzinfektionen bei der Zahl der Todesopfer bei COVID-19 ist die Entdeckung neuer antimykotischer Verbindungen äußerst wichtig.

Bei der Entdeckung neuartiger Arzneimittel gibt es mehrere Ansätze. Erstens suchen Forscher nach neuen Medikamenten, die auf alte Wege (z. B. die Ergosterolsynthese)4 oder Zellmembranen5 abzielen, während andere versuchen, neue Lösungen zu finden. Die Biosynthese von Pilzproteinen, DNA und anderen essentiellen Molekülen ist äußerst wichtig6,7. Was neue Angriffsziele betrifft, sucht unsere Gruppe nach neuen Medikamenten, die auf Pilz-Topoisomerasen abzielen. Es wurden umfangreiche Arbeiten zur Struktur und Funktion der Topoisomerase I und II in Pilzen durchgeführt, und die Ergebnisse zeigten, dass ihre Aktivitäten für einige spezifische Stämme von entscheidender Bedeutung sind8,9,10. Darüber hinaus führte die Hemmung der Hefe-Topoisomerase II zu einer antimykotischen Aktivität11,12 und es gelang sogar, die Fluconazol-Resistenz zu überwinden13,14.

Natürliche Xanthonderivate sind eine vielversprechende Gruppe antimykotischer Verbindungen15,16,17. Sie kommen in der Natur als Metaboliten verschiedener Pflanzen-, Flechten-, Pilz- und Bakterienarten vor18,19. Das interessante Strukturgerüst und die biologische Wirksamkeit dieser Verbindungen veranlassten viele Wissenschaftler dazu, Xanthon-Derivate für die Entwicklung neuer potenzieller Arzneimittelkandidaten als Mittel gegen Krebs, antimikrobielle Mittel, Mittel gegen Malaria, HIV, Antioxidantien, Entzündungshemmer und Mittel gegen Malaria zu synthetisieren20. Es wurden mehrere Artikel veröffentlicht, in denen die antimykotische Wirkung synthetischer Früheren Berichten zufolge ist 1,2-Dihydroxyxanthon die wirksamste Verbindung gegen alle getesteten Pilzstämme und zeigt seine Wirkung auf die Sterinbiosynthese, indem es die nachgewiesene Menge an Ergosterol reduziert24.

Ausgehend von früheren Studien zu Xanthon-Analoga als potenzielle antimikrobielle Mittel15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 haben wir beschlossen, die antimykotische Aktivität von vier neuen Gruppen von Verbindungen zu analysieren. Da berichtet wird, dass Xanthon-Derivate mit Antikrebsaktivität wirksame Inhibitoren der menschlichen Topoisomerase sind20, haben wir auch die hemmende Wirkung ausgewählter Derivate auf die Hefe-Topoisomerase-II-Aktivität (yTOPO II) analysiert.

Die Strukturen der in dieser Studie synthetisierten Xanthon-Derivate sind in vier Gruppen unterteilt (Abb. 1). Die Verbindungen 1–16 und 34 wurden nach einem zuvor veröffentlichten Verfahren25,26 hergestellt, während 25, 26, 35–38 und 41–45 neu synthetisierte Analoga sind (Tabelle 1). Diese Gruppen (I–IV) unterscheiden sich durch die Nitro- oder Aminosubstitution und das Vorhandensein eines Pyrazol- oder Benzol-kondensierten Rings am Xanthonkern (Abb. 1).

Gesamtstrukturen der Derivate, die in dieser Studie analysiert wurden. R1 – Aminosubstitution, R2 oder R3 – NO2 oder H.

Die Liste der in dieser Studie analysierten Xanthon- und Benzoxanthon-Analoga ist in Tabelle 1 dargestellt.

Für die Synthese der neuen Verbindungen haben wir ein analoges Syntheseverfahren mit geringfügigen Änderungen angewendet (Abb. 2 und 3). Kurz gesagt, die Reaktion von Ethylsalicylat (17) oder Ethyl-3-hydroxy-2-naphoat (27) mit 2,4-Dichlornitrobenzol (18) ergab eine Mischung der isomeren Diarylether 19, 20 bzw. 28, 29. Das Verreiben beider Mischungen mit Methanol führte zu reinem 20 und 29, während wir eine 1/1-Mischung aus 19, 20 und 28, 29 erhielten, die nicht weiter gereinigt werden konnte. Für die Synthese der ortho-substituierten Amine 25, 26 und 34 wurde jede der oben genannten Mischungen unter milden Bedingungen verseift. Ohne weitere Reinigung wurde das resultierende Gemisch der Säuren 21, 22 und 30, 31 durch Behandlung mit Polyphosphorsäure (PPA) ringgeschlossen, um die Nitroverbindungen 23, 24 bzw. 32, 33 als untrennbare Gemische zu ergeben. Die Reaktion der obigen Mischungen mit den geeigneten Aminen führte zu den Aminoderivaten 2, 5, 25, 26 bzw. 9, 34. Jedes Aminoderivat wurde in reiner Form durch Säulenchromatographie isoliert und anhand von 1H- und 13C-Spektraldaten identifiziert, wobei sowohl direkte als auch Langzeitexperimente (HMBC und HMQC) zum Einsatz kamen. Um die entsprechenden p-substituierten Nitroderivate 35–38 und 41–45 herzustellen, wurde der Ethylester 29 verseift und durch Behandlung mit PPA ringgeschlossen, um das nitrosubstituierte Benzoxanthon 32 in reiner Form zu ergeben. Folglich wurden die Aminoderivate 35–38 durch nukleophile Substitution der Chlorgruppe von 32 durch entsprechend substituierte Amine hergestellt. Zur Synthese der Amine 41–45 wurden die Verbindungen 37 und 38 in die Mesylate 39 und 40 umgewandelt, die mit den entsprechend substituierten Aminen behandelt wurden, um die Aminoderivate 41–43 bzw. 44–45 zu ergeben.

Reaktion und Bedingungen: (a) K2CO3, Cu2O, DMF trocken, 110 °C; (b) NaOH 40 %, EtOH, RT; (c) PPA, 110 °C; (d) geeignetes Amin, Pyridin, Rückfluss.

Reaktion und Bedingungen: (a) K2CO3, Cu2O, DMF trocken, 110 °C; (b) NaOH 40 %, EtOH, RT; (c) PPA, 110 °C; (d) geeignetes Amin, Pyridin, Rückfluss; (e) geeignetes Amin, Pyridin, Rückfluss; (f) MsCl, Et3N, THF, RT; (g) geeignetes Amin, EtOH, Rückfluss.

Alle 28 Derivate wurden auf ihre antimykotische In-vitro-Aktivität gegen fünf Referenzpilzstämme (von American Type Culture Collection, ATCC) getestet (Tabelle 2). Die aktivsten 13 Verbindungen wurden gegen sechs klinische Isolate von C. albicans getestet, die empfindlich (B3, Gu4 und F2) und resistent (B4, Gu5 und F5) gegenüber Fluconazol sind27,28 (Tabelle 3). Die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) der untersuchten Verbindungen wurden mit der seriellen Verdünnungsmethode der Mikrotiterplatte bestimmt29.

Wie in Tabelle 2 angegeben, ist das Derivat 9 am aktivsten gegen Referenzstämme aus Gruppe III und aus Gruppe IV die Verbindungen 13–15, obwohl es bei letzterem vom Stamm abhängt. Die Analyse der Struktur-Aktivitäts-Beziehungen ergab, dass das Vorhandensein des Naphthalinrings sowie der Nitrogruppe an der R3-Position (Abb. 1) für die antimykotische Aktivität entscheidend ist. Daher beschlossen wir, weitere Derivate der Verbindung 9 (35–38 und 41–45) zu synthetisieren. Dieser Ansatz ermöglichte es uns, ein Derivat mit noch besserer antimykotischer Aktivität (44) gegen Referenzstämme als das Ausgangsderivat 9 zu erhalten.

Für die aktivsten Verbindungen wurde die MHK90 auch gegen sechs klinische Isolate von C. albicans bestimmt, die empfindlich (B3, Gu4 und F2) und resistent (B4, Gu5 und F5) gegenüber Fluconazol sind.

Die Grippe-resistenten klinischen C. albicans B4-, Gu5- und F5-Stämme reagierten empfindlich auf alle von uns ausgewählten Derivate (Tabelle 3). Bei einigen dieser Derivate liegen sie auf dem gleichen Niveau wie bei ihren FLU-empfindlichen Gegenstücken B3, Gu4 und F2, bei anderen sind die MHK-Werte für FLU-resistente Zellen höher, aber immer noch messbar. Die wirksamsten Verbindungen gegen Referenzstämme: 9 sowie 42, 44 und 13–15 zeigten auch die höchste antimykotische Aktivität gegen klinische Stämme, einschließlich solcher, die gegen Grippe resistent waren. Interessanterweise ist die antimykotische Aktivität von Verbindung 15 gegen die Referenzstämme C. glabrata und C. parapsilosis nicht signifikant (Tabelle 2), es wurde jedoch festgestellt, dass sie gegen klinische C. albicans-Stämme, sowohl empfindliche als auch resistente, sehr aktiv ist. Die Stämme Gu4, B3 und F2 sind Fluconazol-empfindliche Isolate, die aus frühen Infektionsepisoden gewonnen wurden, während Gu5, B4 und F5 die entsprechenden Fluconazol-resistenten Isolate sind, die aus späteren Episoden derselben mit Fluconazol behandelten Patienten gewonnen wurden27,28. Im Fall von Gu5 ist die mangelnde Empfindlichkeit gegenüber Fluconazol eine Folge der Überexpression von CDR1/2-Genen, die für ABC-Transporter kodieren, während die Resistenz der Stämme B4 und F5 durch die Überexpression des MDR1-Gens verursacht wird, das für ein Membrantransportprotein des Hauptförderers kodiert Überfamilie (MFS)27,28. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die aktivsten Verbindungen 9, 13–15, 42 und 44 keine Substrate für Pumpen sind, die Arzneimittel aus resistenten Zellen ausströmen lassen, und dass ihre antimykotische Aktivität nicht von der Art der überexprimierten Pumpen abhängt.

Um die mögliche Wirkungsweise von Xanthon- und Benzoxanthon-Analoga zu ermitteln, haben wir die Abtötungsaktivität analysiert und die minimalen fungiziden Konzentrationen (MFCs) für ausgewählte Derivate bestimmt (Tabelle 4).

Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Wirkungsweise der aktivsten Verbindungen fungizid ist. Die höhere fungizide Wirkung wurde für die Derivate 9, 42 und 44 aus Gruppe III und 14 aus Gruppe IV ermittelt. Der Einsatz einer fungiziden Therapie bei invasiver Candidiasis und Candidämie ist mit einer höheren Wahrscheinlichkeit eines frühen Therapieerfolgs verbunden. Es wird auch mit einer verringerten Wahrscheinlichkeit einer anhaltenden oder wiederkehrenden Infektion und Resistenzentwicklung gerechnet. Darüber hinaus fördert die häufige Anwendung verfügbarer fungistatischer Arzneimittel wie Fluconazol die Arzneimittelresistenz30. Vor diesem Hintergrund ist die nachgewiesene Tötungsaktivität der untersuchten Derivate zweifellos ihr Vorteil.

Die Xanthon-Derivate wirken über mehrere Wirkmechanismen als Antikrebsmittel. Die wichtigsten sind die Aktivierung von Caspase-Proteinen und die Hemmung von Proteinkinasen und Topoisomerasen31. Aufgrund der bekannten Aktivität von Xanthon-Derivaten als Inhibitoren der menschlichen Topoisomerase II20,31 haben wir beschlossen, den Einfluss der sechs aktiveren Verbindungen auf das Pilzäquivalent dieses Enzyms zu untersuchen. Die Wirkung ausgewählter Verbindungen auf die durch Hefe-Topoisomerase II vermittelte Relaxationsaktivität lässt auf ihr molekulares Ziel schließen (Tabelle 5 und Abb. 4).

Hemmung der katalytischen Aktivität der gereinigten Hefe-DNA-Topoisomerase II durch die Verbindungen 9, 14, 42 und 44, gemessen durch Relaxation. Superspiralisierte pBR322-Plasmid-DNA (-TOPO II) wurde durch gereinigte Hefetopoisomerase II in Abwesenheit (+ TOPO II) oder Anwesenheit der analysierten Verbindungen 14, 42 und 44 in Konzentrationen von 1–150 μM oder 1–50 μM für 9 (höhere Konzentrationen) relaxiert wurden aufgrund der geringen Löslichkeit der Verbindung nicht getestet. Die resultierenden topologischen DNA-Formen wurden durch Gelelektrophoresen aufgetrennt. SC, superspiralisierte DNA; R, entspannte DNA; T, DNA-Topoisomere. Die gezeigten Daten sind typisch für drei unabhängige Experimente und es wird ein Satz repräsentativer Bilder gezeigt. Originalgele sind in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt.

Wie in Tabelle 5 angegeben, sind die Verbindungen 42 und 44 die wirksamsten Inhibitoren der Pilz-Topoisomerase II. Überraschenderweise wurde im getesteten Konzentrationsbereich keine Hemmung für Verbindung 9 beobachtet, die eng mit den Derivaten 42 und 44 verwandt ist. Daher kann die molekulare Wirkungsweise zwischen diesen Verbindungen variieren und erfordert eine eingehendere Analyse.

Ausgewählte Verbindungen wurden mithilfe eines kolorimetrischen MTT-Assays auf ihre antiproliferative In-vitro-Aktivität gegenüber einer menschlichen embryonalen Nierenzelllinie (HEK-293) und einer menschlichen Leberkrebszelllinie (HEPG2) untersucht. Unsere Ergebnisse wurden mit der zuvor für die humane kolorektale Adenokarzinomzelllinie (HT29)26 ermittelten zytotoxischen Aktivität verglichen und sind in Tabelle 6 dargestellt.

Wie für Etoposid und Doxorubicin32, beides Chemotherapeutika zur Behandlung verschiedener Krebsarten, angegeben, liegen die Ergebnisse für neu synthetisierte Verbindungen innerhalb akzeptabler Zytotoxizitätswerte. Um die Selektivität in Bezug auf Säugetierzellen abzuschätzen, wurde der mykostatische Selektivitätsindex (MSI) für C. albicans ATCC 10231 als Verhältnis von EC50- zu MIC90-Werten nach Umrechnung des MIC90-Werts in mikromolare Konzentrationen berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt.

Für alle ausgewählten Derivate wurden positive mykostatische Selektivitätsindexwerte (MSI = EC50/MIC90) im Bereich von 0,105 bis 0,655 erhalten. Unsere Ergebnisse weisen auf die Möglichkeit hin, Xanthon-Derivate als wirksame Antimykotika einzusetzen. Es ist jedoch notwendig, ihre Selektivität zu verbessern. Am interessantesten ist Verbindung 44, für die mit HEPG2-Zellen ein höherer MSI-Wert erzielt wurde. Die aus menschlichem Leberkrebs stammende HEPG2-Zelllinie wird am häufigsten in Studien zum Arzneimittelstoffwechsel und zur Toxizität verwendet33.

Alle im Handel erhältlichen Reagenzien und Lösungsmittel wurden von Alfa Aesar gekauft und ohne weitere Reinigung verwendet. Die Schmelzpunkte wurden mit einem Büchi-Gerät bestimmt und waren unkorrigiert. Alle NMR-Spektren wurden mit 400- oder 600-MHz-Bruker-Spektrometern bzw. Avance™ DRX- und III-Instrumenten (Bruker BioSpin GmbH – Rheinstetten, Deutschland) aufgezeichnet. 1H-NMR-Spektren (400 und 600 MHz) und 13C-NMR-Spektren (101 und 151 MHz, aufgenommen mit vollständiger Protonenentkopplung) wurden mit in CDCl3 oder DMSO-d6 gelösten Proben erhalten, wobei die Restlösungsmittelsignale als interne Referenzen dienten: 7,26 ppm für CHCl3, und 2,50 ppm für (CD3)(CD2H)S(O) bezüglich 1H-NMR-Experimenten; 77,2 ppm für CDCl3 und 39,4 ppm für (CD3)2S(O) bezüglich 13C-NMR-Experimenten. Chemische Verschiebungen (δ) werden in ppm mit einer Genauigkeit von 0,01 (1H) bzw. 0,1 ppm (13C) angegeben. Die Kopplungskonstanten (J) werden in Hertz (Hz) angegeben. Die Signale werden wie folgt angegeben: (s = Singulett, d = Dublett, t = Triplett, m = Multiplett, br = breit). Mithilfe von D/H-Austausch- und 2D-Techniken konnten eindeutige Zuordnungen der 1H- und 13C-NMR-Signale erzielt werden: COSY-, NOESY-, HMQC- und HMBC-Experimente. Die Verbindungen 1–8, 10–16 und 34 wurden gemäß der Literatur synthetisiert und ihre 1H-NMR- und 13C-NMR-Spektren mit denen in der Literatur25,26 verglichen. Die Flash-Chromatographie wurde auf Merck-Kieselgel (40–63 μm) mit dem angegebenen Lösungsmittelsystem durchgeführt, wobei in den meisten Fällen Gradienten zunehmender Polarität verwendet wurden (Merck KGaA – Darmstadt, Deutschland). Die Reaktionen wurden durch analytische Dünnschichtchromatographie (vorbeschichtete Silicagel 60 F254 TLC-Platten von Merck, 0,25 mm Schichtdicke) überwacht. Die Verbindungen wurden auf TLC-Platten sowohl durch UV-Strahlung (254 als auch 365 nm) sichtbar gemacht. Alle Lösungsmittel für Absorptions- und Fluoreszenzexperimente waren von spektroskopischer Qualität. Massenspektren wurden mit einem UPLC Triple TOF–MS {UPLC:Acquity of Waters (USA), SCIEX Triple TOF–MS 5600 + (USA)} aufgezeichnet.

Eine Lösung aus Ethylsalicylat (1,66 g, 10 mmol, 17), 2,4-Dichlornitrobenzol (1,91 g, 9,95 mmol, 18), K2CO3 (1,38 g, 10 mmol) und Cu2O (142 mg, 1 mmol) in trockenem DMF (10 ml) wurde 12 Stunden lang unter einer Argonatmosphäre auf 110 °C erhitzt. Nach Abschluss der Reaktion wurde die Mischung heiß filtriert, mit EtOAc gewaschen und das Filtrat im Vakuum eingedampft. Der ölige Rückstand wurde in CH2Cl2 verdünnt, mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Wasser getrocknet. Na2SO4 gelöst und zur Trockne eingedampft. Der erhaltene ölige Rückstand wurde unter Rühren mit heißem Ethanol (15 ml) verrieben und nach dem Abkühlen filtriert, um 1,0 g (36 %) 20 und 1,2 g (44 %) einer öligen Mischung aus den Estern 19 und 20 zu ergeben, die für verwendet wurde der nächste Schritt ohne weitere Reinigung. Zu einer Suspension der obigen Mischung in Ethanol (10 ml) wurde eine kalte 40 %ige NaOH-Lösung gegeben und die resultierende Mischung 40 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Mischung in Eiswasser gegossen und mit 18 %iger HCl-Lösung angesäuert. Die resultierende Mischung der Säuren 21 und 22 wurde filtriert, über P2O5 getrocknet und in heißer Polyphosphorsäure gelöst. Die resultierende Mischung wurde 1 Stunde lang bei 110 °C gerührt und nach dem Abkühlen auf Eis gegossen, und der Niederschlag wurde filtriert und über P2O5 getrocknet, um die Xanthone 23 und 24 zu ergeben, die ohne weitere Reinigung für den nächsten Schritt verwendet wurden. Daher wurden 23 und 24 und das geeignete Amin in trockenem Pyridin 1 1/2 Stunden lang unter Rückfluss erhitzt. Nach Abschluss der Reaktion wurde das Pyridin im Vakuum abgedampft, der ölige Rückstand wurde in EtOAc verdünnt, mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Wasser getrocknet. Na2SO4 gelöst und zur Trockne eingedampft. Flash-Chromatographie auf Kieselgel unter Verwendung einer Mischung aus CH2Cl2/MeOH 93/7 als Elutionsmittel ergab die Titelverbindungen 25, 26 und ihre Isomere 226 bzw. 526.

Ausbeute: 12 %; Schmp. 123–124 °C (EtOAc–n-Hexan); 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10,89 (s br, D2O-Austausch, 1H), 8,26 (dd, J = 7,9, 1,7 Hz, 1H), 8,09 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,69 (td , J = 7,9, 1,7 Hz, 1H), 7,46–7,36 (m, 2H), 6,57 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 3,03 (q, J = 5,7 Hz, 2H), 2,72 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 2,65 (q, J = 7,1 Hz, 4H), 1,08 (t, J = 7,1 Hz, 6H). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) δ 179,0, 161,0, 155,1, 148,2, 135,2, 134,3, 130,6, 126,8, 125,2, 122,2, 117,8, 109,8, 104,0, 52,1, 47,2, 45,4, 12,0. ( +) ESI QqToF (m/z): Berechnet. für C19H22N3O4+: [M + H]+ 356,1605, gefunden 356,1614.

Ausbeute: 9 %; Schmp. 173–175 °C (EtOAc–n-Hexan); 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10,88 (t, D2O-Austausch, J = 4,7 Hz, 1H), 8,21 (dd, J = 7,9, 1,7 Hz, 1H), 8,06 (d, J = 9,3 Hz, 1H) , 7,68 (td, J = 8,6, 1,7 Hz, 1H), 7,45–7,32 (m, 2H), 6,56 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 3,13 (q, J = 6,3 Hz, 2H), 2,84 ( t, J = 6,3 Hz, 2H), 2,66 (m, 4H), 1,85 (m, 4H). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) δ 178,9, 160,5, 154,6, 147,6, 134,9, 133,9, 130,1, 126,3, 124,8, 121,6, 117,4, 109,2, 103,7, 54,9, 54,0, 46,0, 23,7. ( +) ESI QqToF (m/z): Berechnet. für C19H20N3O4+: [M + H]+ 354,1448, gefunden 354,1440.

Diese Verbindung wurde durch ein analoges Verfahren wie für 26 beschrieben hergestellt, ausgehend von Ethyl-3-hydroxy-2-naphoat (27) mit 2,4-Dichlornitrobenzol (18). Flash-Chromatographie auf Kieselgel unter Verwendung einer Mischung aus CH2Cl2/MeOH 94/6 als Elutionsmittel ergab die Titelverbindung 34 und die para-Nitro-Substituentenverbindung 926. Ausbeute: 12 %; Schmp. > 220 °C (EtOAc); 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10,99 t, D2O-Austausch, J = 6,0 Hz, 1H), 8,85 (s, 1H), 8,17 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 8,08 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,93 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,86 (s, 1H), 7,66 (t, J = 8,3 Hz, 1H), 7,55 (t, J = 8,3 Hz, 1H), 6,73 ( d, J = 9,4 Hz, 1H), 3,31 (q, J = 6,5 Hz, 2H), 3,03 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 2,88 (m, 4H), 1,96 (m, 4H). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) δ 180,0, 161,2, 150,6, 148,0, 136,8, 134,5, 130,3, 130,2, 129,8, 129,6, 128,3, 127,2, 126,2, 120,6, 113. 4, 108,6, 105,5, 54,0, 43,3, 23,5. ( +) ESI QqToF (m/z): Berechnet. für C23H22N3O4+: [M + H]+ 401,1605, gefunden 401,1616.

Eine Lösung aus reinem Benzo[b]xanthon 32, erhalten aus der Synthese von 34, und dem geeigneten Amin (× 10 Äquiv.) in trockenem Pyridin (5 ml) wurde 2 Stunden lang unter Rückfluss erhitzt. Nach Abschluss der Reaktion wurde das Pyridin im Vakuum abgedampft, der ölige Rückstand wurde in EtOAc verdünnt, mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Wasser getrocknet. Na2SO4 gelöst und zur Trockne eingedampft. Flash-Chromatographie auf Kieselgel mit einer Mischung aus CH2Cl2/MeOH 100/1 als Elutionsmittel lieferte die Titelverbindungen 35–38.

Ausbeute: 91 %; Öl; 1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ 10,95 (t, J = 5,0 Hz, 1H), 8,77 (s, 1H), 8,32 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 8,01 (d, J = 8,3 Hz, 1H ), 7,99 (s, 1H), 7,92 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,62 (t, J = 8,2 Hz, 1H), 7,51 (t, J = 8,1 Hz, 1H), 6,42 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 3,88 (m, 4H), 3,76–3,73 (m, 2H), 3,59 (q, J = 5,2 Hz, 2H). 13C NMR (600 MHz, CDCl3) δ 180,1, 155,9, 154,0, 150,7, 136,9, 134,1, 130,4, 129,8, 129,5, 127,8, 127,5, 126,3, 125,5, 120,9, 114. 3, 104,8, 103,4, 72,9, 68,6, 62,1, 42,8 . ( +) ESI QqToF (m/z): Berechnet. für C21H19N2O6+: [M + H]+ 395,1238, gefunden 395,1248.

Ausbeute: 84 %; Schmp. > 220 °C (EtOAc); 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10,78 (s, 1H), 8,77 (s, 1H), 8,33 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 8,02 (d, J = 9,9 Hz, 2H), 7,93 (d , J = 8,4 Hz, 1H), 7,63 (t, J = 8,2 Hz, 1H), 7,52 (t, J = 8,2 Hz, 1H), 6,50 (d, J = 9,7 Hz, 1H), 3,91 (t, J = 5,8 Hz, 2H), 3,57 (q, J = 6,2 Hz, 2H), 2,07 (m, 2H). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) δ 180,0, 156,1, 154,0, 150,7, 136,8, 134,0, 130,3, 129,8, 129,5, 127,6, 127,5, 126,3, 125,3, 120,9, 114. 3, 104,6, 103,4, 60,3, 40,3, 31,5. ( +) ESI QqToF (m/z): Berechnet. für C20H16N2O5Na+: [M + Na]+ 387,0951, gefunden 387,0962.

Ausbeute: 89 %; Schmelzpunkt > 220 °C (EtOH-H2O); 1H-NMR (400 MHz, CDCl3, MeOD) δ 8,75 (s, 1H), 8,30 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 8,01 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,97 (s, 1H), 7,91 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,61 (t, J = 8,4 Hz, 1H), 7,50 (t, J = 8,3 Hz, 1H), 6,53 (d, J = 9,7 Hz, 1H), 3,89 (t , J = 5,6 Hz, 2H), 3,54 (t, J = 5,6 Hz, 2H). 13C NMR (400 MHz, CDCl3, MeOD) δ 180,4, 156,7, 154,5, 151,0, 137,3, 134,4, 130,8, 130,1, 129,9, 128,0, 127,9, 126,7, 125,5, 121,3, 1 14,6, 105,0, 104,2, 60,4, 45,7. (-) ESI QqToF (m/z): Berechnet. für C19H13N2O5−: [M—H]− 349,0830, gefunden 349,0825.

Ausbeute: 94 %; Schmp. 174–176 °C (EtOAc); 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10,76 (s, 1H), 8,78 (s, 1H), 8,32 (d, J = 9,7 Hz, 1H), 8,03 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 8,00 (s , 1H), 7,93 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,63 (t, J = 8,3 Hz, 1H), 7,52 (t, J = 8,1 Hz, 1H), 6,48 (d, J = 9,7 Hz, 1H ), 3,57 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 3,55–3,49 (m, 2H), 3,41 (s, 3H), 2,05 (m, 2H). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) δ 179,9, 156,1, 154,0, 150,7, 136,8, 134,0, 130,3, 129,8, 129,4, 127,6, 127,5, 126,2, 125,3, 121,0, 114. 2, 104,6, 103,4, 69,9, 59,0, 40,6, 29,2 . ( +) ESI QqToF (m/z): Berechnet. für C21H18N2O5Na+: [M + Na]+ 401,1108, gefunden 401,1115.

Methansulfonylchlorid (82 μL, 1,05 mmol) wurde bei 0 °C tropfenweise zu einer Suspension von 36 (1 mmol) oder 37 (1 mmol) und Et3N (279 μL, 2 mmol) in trockenem CH2Cl2 (10 ml) gegeben und die resultierende Suspension wurde mit Methansulfonylchlorid (82 μL, 1,05 mmol) versetzt Die Mischung wurde 6 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abschluss der Reaktion wurde die Mischung mit 1 N HCl (2 × 5 ml) und Wasser (2 × 5 ml) gewaschen und die organische Schicht über Na2SO4 getrocknet und im Vakuum eingedampft. Ohne weitere Reinigung wurde das erhaltene Rohmesylat (39 bzw. 40) in absolutem Ethanol (10 ml) gelöst und dieser Lösung ein geeignetes Amin (× 10 Äquiv.) zugesetzt. Die resultierende Lösung wurde 12 Stunden lang unter Rückfluss gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel im Vakuum verdampft und der ölige Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel unter Verwendung einer Mischung aus CH2Cl2/MeOH 9/1 als Elutionsmittel gereinigt, um die Titelverbindungen 41–43 und 44–45 zu ergeben.

Ausbeute: 77 %; Schmp. 179–180 °C (EtOAc–n-Hexan); 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10,73 (t, D2O-Austausch, J = 5,5 Hz, 1H), 8,73 (s, 1H), 8,30 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 8,00 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,97 (s, 1H), 7,91 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,62 (t, J = 8,2 Hz, 1H), 7,50 (t, J = 8,2 Hz, 1H), 6,47 (d, J = 9,7 Hz, 1H), 3,77 (m, 4H), 3,47 (q, J = 6,4 Hz, 2H), 2,59–2,45 (m, 6H), 1,96 (p, J = 6,4 Hz, 2H) . 13C NMR (400 MHz, CDCl3) δ 179,7, 155,9, 153,8, 150,5, 136,6, 133,8, 130,2, 129,6, 129,3, 127,4 (2 C), 126,1, 125,1, 120,8, 114,1, 1 04,4, 103,3, 67,0, 56,0, 53,8 , 41,3, 25,7. ( +) ESI QqToF (m/z): Berechnet. für C24H24N3O5+: [M + H]+ 434,1710, gefunden 434,1717.

Ausbeute: 81 %; Öl; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10,74 (t, D2O-Austausch, J = 5,4 Hz, 1H), 8,73 (s, 1H), 8,30 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 8,06–8,00 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 7,96 (s, 1H), 7,94–7,89 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 7,63 (t, J = 8,2 Hz, 1H), 7,51 (t, J = 8,2 Hz, 1H), 6,46 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 3,47 (q, J = 6,3 Hz, 2H), 2,81 (m, 4H), 2,67 (m, 4H), 2,61 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 2,54 (s, 3H), 1,97 (p, J = 6,3 Hz, 2H). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) δ 179,5, 155,6, 153,6, 150,3, 136,5, 133,6, 130,0, 129,5, 129,2, 127,2, 127,1, 126,0, 125,0, 120,5, 114. 0, 104,2, 103,1, 55,3, 54,1, 51,5, 44,7 , 41,4, 25,5. ( +) ESI QqToF (m/z): Berechnet. für C25H27N4O4 + : [M + H]+ 447,2027, gefunden 447,2024.

Ausbeute: 79 %; Schmp. 175–176 °C (EtOAc–n-Hexan); 1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ 10,73 (t, D2O-Austausch, J = 5,3 Hz, 1H), 8,77 (s, 1H), 8,32 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 8,02 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,99 (s, 1H), 7,93 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,63 (t, J = 8,2 Hz, 1H), 7,52 (t, J = 8,2 Hz, 1H), 6,50 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 3,53 (q, J = 6,9, 2H), 2,80 (t, J = 6,9 Hz, 2H), 2,76 (brs, 4H), 2,10 (p, J = 7,0 Hz, 2H), 1,91 (brs, 4H). 13C NMR (600 MHz, CDCl3) δ 179,8, 155,8, 153,7, 150,5, 136,7, 133,8, 130,2, 129,6, 129,3, 127,4, 127,3, 126,0, 125,2, 120,8, 114. 1, 104,4, 103,3, 54,0, 53,4, 41,3, 27,4 , 23.5. ( +) ESI QqToF (m/z): Berechnet. für C24H24N3O4+: [M + H]+ 418,1761, gefunden 418,1764.

Ausbeute: 82 %; Schmp. > 220 °C (Zers.) (EtOAc – n-Hexan); 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10,87 (s, D2O-Austausch, 1H), 8,84 (s, 1H), 8,35 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 8,06 (d, J = 8,4 Hz, 1H) , 8,02 (s, 1H), 7,94 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,68–7,61 (m, 1H), 7,58–7,48 (m, 1H), 6,45 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 3,84 (m, 4H), 3,49 (brs, 2H), 2,80 (brs, 2H), 2,61 (m, 4H). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) δ 179,8, 155,7, 154,0, 150,7, 136,8, 134,0, 130,4, 129,8, 129,4, 127,7, 127,5, 126,2, 125,5, 121,1, 114. 3, 104,8, 103,6, 67,2, 56,4, 53,6, 40,2 . ( +) ESI QqToF (m/z): Berechnet. für C23H22N3O5+: [M + H]+ 420,1554, gefunden 420,1560.

Ausbeute: 68 %; Schmp. > 220 °C (Zers.) (EtOAc–n-Hexan); 1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ 10,83 (t, D2O-Austausch, J = 4,8 Hz, 1H), 8,81 (s, 1H), 8,34 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 8,05 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 8,01 (s, 1H), 7,94 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,64 (t, J = 8,2 Hz, 1H), 7,53 (t, J = 8,2 Hz, 1H), 6,43 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 3,48 (q, J = 5,8 Hz, 2H), 3,02–2,74 (m, 10H), 2,57 (s, 3H). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) δ 180,0, 155,9, 154,2, 151,0, 137,1, 134,2, 130,6, 130,0, 129,7, 127,8, 127,8, 126,5, 125,8, 121,3, 114. 5, 105,1, 103,8, 55,7, 54,9, 51,6, 45,3 , 40,6. ( +) ESI QqToF (m/z): Berechnet. für C24H25N4O4+: [M + H]+ 433,1870, gefunden 433,1870.

Die folgenden Referenz- und klinischen Pilzstämme wurden verwendet: C. albicans ATCC 10231, C. glabrata ATCC 90030, C. krusei ATCC 6258, C. parapsilosis ATCC 22019, S. cerevisiae ATCC 9763, C. albicans B3, C. albicans B4, C. albicans Gu4, C. albicans Gu5, C. albicans F2, C. albicans F527,28. Die in dieser Untersuchung verwendeten Pilzstämme wurden routinemäßig über 18 Stunden bei 30 °C in flüssigem YPG-Medium (1 % Hefeextrakt, 1 % Pepton, 2 % Glucose) in einem Schüttelinkubator gezüchtet. Für das Wachstum auf festen Medien wurde dem YPG-Medium 1,5 % Agar zugesetzt.

Die antimykotische In-vitro-Aktivität wurde anhand des vom CLSI29 spezifizierten modifizierten M27-A3 durch Bestimmung minimaler Hemmkonzentrationen (MICs) wie zuvor beschrieben14 bestimmt. Die MHK wurde als die niedrigste Arzneimittelkonzentration definiert, bei der im Vergleich zur wirkstofffreien Kontrolle eine mindestens 90-prozentige Abnahme der Trübung beobachtet wurde. Die antimykotische Aktivität wurde in RPMI-1640-Medium, gepuffert auf pH 7,0, bestimmt. Die Endkonzentration des Verbindungslösungsmittels (DMSO) überstieg in jeder Vertiefung nicht das Volumen von 2,5 % der Endsuspension und hatte keinen Einfluss auf das Wachstum der Mikroorganismen.

Die minimalen fungiziden Konzentrationen (MFCs) wurden wie zuvor beschrieben13 durch Stichprobenbestimmung bestimmt. Der MFC wurde als die niedrigste Konzentration der Testverbindung bestimmt, bei der keine Erholung der Mikroorganismen beobachtet wurde.

Die Hemmung der Hefe-Topoisomerase II wurde mit dem Relaxations-Assay-Kit von Inspiralis (Inspiralis Limited, Norwich, UK) und wie zuvor beschrieben analysiert14. Die Wirksamkeit der Relaxationshemmung (IC50) der analysierten Verbindungen wurde durch densitometrische Quantifizierung des Übergangs von superspiralisierten zu entspannten Formen bestimmt und im Verhältnis zur Kontrolle ausgedrückt. Die Gele wurden mit dem Gel Doc XR + Gel Documentation System (Bio-Rad: Hercules, CA, 647 USA) fotografiert und die Bildverarbeitung wurde mit GIMP 2.10.18 durchgeführt.

Die menschliche embryonale Nierenzelllinie (HEK-293) und die menschliche Leberkrebszelllinie (HEPG2) wurden von ATCC (Manassas, Virginia, USA) erworben. HEK-293 wurde in Dulbeccos Modified Eagle Medium und HEPG2 in Minimum Essential Medium Eagle kultiviert. Für jede Zelllinie wurde das Kulturmedium mit 10 % fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und Antibiotika ergänzt: Penicillin 62,6 μg ml–1 und Streptomycin 40 μg ml–1. Die Zellen wurden in der feuchten Atmosphäre von 5 % CO2/95 % Luft kultiviert und routinemäßig auf Mykoplasmenkontamination getestet. Die antiproliferative Aktivität der Verbindungen wurde wie zuvor beschrieben mit der MTT-Methode14 bestimmt. Der Prozentsatz der Zelllebensfähigkeit wurde berechnet und die EC50-Werte wurden mit der GraphPad Prism®-Software (Version 8.3.1) bestimmt.

28 Xanthon- und Benzoxanthon-Analoga wurden synthetisiert und auf ihre antimykotische Aktivität untersucht. Benzoxanthone erwiesen sich als die besten Antimykotika mit positiven Werten für den mykostatischen Selektivitätsindex in Bezug auf HEK293- und HEPG2-Zelllinien. Der kondensierte Benzolring ist daher entscheidend für ihre Aktivität. Die Bewertung der biologischen Eigenschaften legt nahe, dass die Wirkungsweise der wirksamsten Derivate fungizid ist. Die nachgewiesene Abtötungsaktivität geht mit einer höheren Wahrscheinlichkeit eines frühen Therapieerfolgs und einer verringerten Wahrscheinlichkeit einer Resistenzentwicklung einher. Darüber hinaus blieben die klinischen Stämme von C. albicans, die aufgrund der FLU-induzierten Überexpression von Cdr1p/Cdr2p-Arzneimittelausflusspumpen sowie des Mdr1p-Membrantransportproteins der Major Facilitator Superfamilie (MFS) gegen Fluconazol resistent waren, gegenüber unseren neuen Verbindungen empfindlich. Dieser Befund legt nahe, dass die gegen klinisch resistente Stämme wirksamsten Verbindungen 9, 42 und 44 keine guten Substrate für ABC- und MFS-Effluxpumpen sind.

Da es sich bei Xanthonderivaten um Inhibitoren der menschlichen Topoisomerase handelt, könnte die antimykotische Aktivität der analysierten Verbindungen mit ihrer hemmenden Wirkung auf das Pilzäquivalent dieses Enzyms zusammenhängen. Unsere Ergebnisse deuten auf einen starken Zusammenhang zwischen der antimykotischen Aktivität und der Hemmwirkung gegen Hefe-Topoisomerase II hin.

Zusammenfassend konnten wir einen Proof of Concept zeigen, dass die Xanthonmodifikation zur Entdeckung einer neuen Gruppe selektiver Antimykotika führen könnte, die die Topoisomerase II von Pilzen beeinflussen. Darüber hinaus deuten unsere Ergebnisse auf die Möglichkeit hin, diese Derivate gegen resistente Pilzzellen einzusetzen. Eine weitere Validierung der Anwendbarkeit von Xanthonen als Antimykotika durch die Entwicklung, Synthese und Bewertung der Aktivität neuer Inhibitoren ist von großem Wert. Zukünftige Untersuchungen werden sich auf die Verbesserung der Selektivität konzentrieren.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten.

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Abteilung für Pharmazeutische Technologie und Biochemie, Fakultät für Chemie und BioTechMed-Zentrum, Technische Universität Danzig, 11/12 Narutowicza Str., 80-233, Danzig, Polen

Regierung Kamila, Mateusz Olszewski und Iwona Gabriel

Abteilung für Pharmazeutische Chemie, Abteilung für Pharmazie, Fakultät für Gesundheitswissenschaften, Nationale und Kapodistrias-Universität Athen, Panepistimiopolis, 15771, Zografou, Griechenland

Rachel Ioannidi, Panagiotis Marakos, Nicole Pouli und Ioannis K. Kostakis

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KR führte die Experimente zur Bestimmung der antimykotischen Aktivität und Studien zur Topoisomerase-II-Hemmung durch, analysierte Daten und verfasste ein Manuskript. RI führte die Synthese der Verbindungen durch und verfasste das Manuskript; PM analysierte Daten; NP analysierte Daten; MO führte Experimente zur zytotoxischen Aktivität durch und analysierte Daten; IKK und IG konzipierten die Experimente, analysierten Daten und verfassten Manuskripte. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Iwona Gabriel.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 13. März 2023

Angenommen: 18. Juli 2023

Veröffentlicht: 23. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38963-4

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