Bewertung der In-vitro-Biokompatibilität menschlicher Pulpastammzellen mit allogenen, alloplastischen und xenogenen Transplantaten unter dem Einfluss extrazellulärer Vesikel

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12475 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Therapien mit Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs) oder aus Stammzellen gewonnenen extrazellulären Vesikeln (EVs) haben vielversprechende Anwendungen für das Knochengewebe-Engineering gezeigt. Dieses In-vitro-Experiment bewertete die gemeinsame osteogene Fähigkeit von DPSCs und EVs auf alloplastischen (Maxresorp), allogenen (Maxgraft) und xenogenen (Cerabone) Knochentransplantaten. Wir nehmen an, dass die osteogene Differenzierung und die Proliferation menschlicher DPSCs zwischen Knochentransplantaten variieren und unter dem Einfluss von EVs günstig sind. DPSCs wurden aus menschlichen Weisheitszähnen gewonnen und von DPSCs abgeleitete EVs wurden aus Zellkulturmedium isoliert. DPSCs wurden zur Kontrolle auf alloplastische, allogene und xenogene Knochentransplantatersatzstoffe ausgesät, und die gleichen Gerüste wurden in weiteren Gruppen mit EVs verabreicht. Die zelluläre Aufnahme von Elektrofahrzeugen in DPSC-Zellen wurde durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie bewertet. Zellvitalitätsfärbung und Calceinacetoxymethylester-Färbung wurden verwendet, um die Zellanhaftung und -proliferation zu bewerten. Die Zellmorphologie wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie bestimmt und die osteogene Differenzierung wurde durch alkalische Phosphatase und Alizarinrot-Färbung untersucht. Innerhalb der Grenzen einer In-vitro-Studie ohne Pathologien deuten die Ergebnisse darauf hin, dass insbesondere die Verwendung von xenogenen Knochentransplantatersatzstoffen mit DPSCS und EVs einen vielversprechenden Behandlungsansatz für Alveolarknochendefekte darstellen könnte.

Knochendefekte des Alveolarkamms treten in der Regel als Folge von Zahnverlust, Entzündung, Trauma oder Pathologie auf und stellen ein großes Problem bei der Zahn- oder Implantatrehabilitation dar. Augmentationsverfahren zielen daher darauf ab, ausreichend Knochenvolumen für die Implantatinsertion zu erzeugen1. Zur Augmentation von Knochendefekten können unterschiedliche Knochenaufbaumaterialien verwendet werden. Aufgrund ihrer osteogenen, osteoinduktiven und osteokonduktiven Eigenschaften stellen Knochentransplantate autologen Ursprungs den Goldstandard für die Therapie knöcherner Defekte im menschlichen Kiefer dar, sind jedoch mit erheblichen Nachteilen wie spenderseitiger Morbidität2, mehreren erforderlichen chirurgischen Eingriffen usw. verbunden längere Operationszeiten3. Neben autologem Knochen können auch allogene, xenogene und alloplastische Knochenersatzstoffe (BGS) zur Augmentation von Knochendefekten eingesetzt werden. Knochenersatzstoffe bieten den Vorteil, dass es zu keiner Entnahmemorbidität kommt, sie sind dem autologen Knochen derzeit jedoch in Bezug auf Osteogenese, Osteoinduktion und Osteokonduktion unterlegen. Daher wurde viel Forschung betrieben, um die Eigenschaften von BGS zu verbessern.

Multipotente mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind adulte Stammzellen, die aus einer Vielzahl von Geweben isoliert werden können4,5,6,7. Im Jahr 2000 wurden MSCs erstmals aus dem gesunden Pulpagewebe extrahierter dritter Molaren isoliert8. Zusätzlich zu ihrer schnellen Proliferation und Fähigkeit zur Koloniebildung9 haben von DPSCs abgeleitete MSCs ein starkes Differenzierungspotenzial zu Osteoblasten, Adipozyten, Chondrozyten, Odontoblasten und Neuronen gezeigt10. Im Vergleich zu aus Knochenmark gewonnenen MSCs haben DPSCs eine höhere Proliferationsrate10, sind klonogene Zellen und haben ein vielversprechendes regeneratives Potenzial zur Behandlung schwerer Gewebeschäden, was DPSCs zu einem häufig untersuchten Stammzelltyp unter den in der Forschung untersuchten MSCs macht. Die Fähigkeit, sich in knochenbildende Zellen zu differenzieren, macht DPSCs zu einer vielversprechenden Therapieoption in der regenerativen Medizin bei Knochenmangel3,11.

Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die vorteilhaften regenerativen Wirkungen der stammzellbasierten Therapie höchstwahrscheinlich durch ihre parakrinen Prozesse gesteuert werden9,12,13,14,15,16,17. EVs werden von Zellen auf parakrine Weise sezerniert, sind von einer Lipiddoppelschichtstruktur umgeben und haben einen Durchmesser von etwa 150–180 nm. Sie enthalten genetische Substanzen wie microRNAs (miRNAs) und EVs sind in Form von Exosomen oder Mikrovesikeln Teil der Zell-zu-Zell-Kommunikation18,19,20,21. MicroRNAs sind nichtkodierende RNA-Komponenten, die die Translation von mRNA hemmen. Damit sind sie ein elementarer Bestandteil der Zellproliferation und Zelldifferenzierung22. Die Zielspezifität und die modulierenden Gene von miRNAS hängen mit der Osteogenese zusammen und fördern folglich die osteogene Differenzierung von MSCs und induzieren so die Regeneration des Knochengewebes23.

Beeinträchtigungen durch abbauende Enzyme haben in der Vergangenheit häufig die Verwendung von miRNAs in Studien zum Knochenumbau eingeschränkt24. Diese Einschränkungen könnten durch die Produktion natürlich gewonnener Elektrofahrzeuge überwunden werden, da diese Vesikel zum Transport von miRNAs zu Zielzellen verwendet werden können25. EVs haben den Vorteil, dass sie leicht aus Körper- oder Zellkulturflüssigkeiten gewonnen werden können26,27, und sie zeichnen sich durch Stabilität mit geringer Anfälligkeit aus, lösen, wenn überhaupt, nur eine geringe Immunantwort aus und verfügen über einen intrinsischen Homing-Effekt, der die Aufnahme von EVs mit osteogenen miRNAs begünstigt durch Zielzellen28. Neue Ansätze der Stammzelltherapie werden daher um den Einsatz von Elektrofahrzeugen erweitert9,13.

Angesichts der Tatsache, dass EVs und DPSCs eine wichtige Rolle in zellbasierten Therapien spielen16 und dass EVs möglicherweise die Proliferation und Differenzierung von DPSCs bei der Osteogenese modulieren können, scheint eine Untersuchung von DPSCs auf verschiedenen Gerüsten und EV-Wechselwirkungen für die Entwicklung neuer Therapien für Knochen von wesentlicher Bedeutung zu sein Mängel. Derzeit gibt es nicht genügend Studien, die die osteogene Zellreaktion von DPSC unter dem Einfluss von EVs auf verschiedene konventionelle BGSs in vitro untersucht haben. Ziel dieser Studie war es daher, die Internalisierung von EVs in DPSCs zu untersuchen und den Einfluss auf die Anhaftung, das Wachstum und die osteogene Differenzierung von DPSCs an alloplastischen, xenogenen und allogenen Knochengerüsten unter dem Einfluss von EVs zu bestimmen.

Wie bereits beschrieben29, wurden DPSCs aus drei betroffenen dritten Molaren erzeugt, die bei gesunden erwachsenen Männern in der Abteilung für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie der RWTH Aachen entfernt wurden. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der RWTH Aachen (EK 374/19) durchgeführt. Von allen Teilnehmern wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Die Zähne wurden in Chlorhexidin gelegt, bevor sie mit sterilen Zahnspaltbohrern an der Zement-Schmelz-Grenze geöffnet wurden. Mit sterilen Stachelnadeln wurde das Pulpagewebe von der Krone und der Wurzel abgetrennt. Vor der Isolierung von DPSC wurde eine gemischte Enzymlösung unter Verwendung von 1 ml Kollagenase Typ I (12 mg/ml), 1 ml Dispase (16 mg/ml) in 2 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hergestellt 100 mg/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin. Das zerkleinerte Zellstoffgewebe wurde zur Verdauung für 60 Minuten bei 37 °C in die vorbereitete Enzymlösung überführt und alle 30 Minuten verwirbelt. Unter Verwendung eines 70 μM-Zellsiebs wurden alle großen Zellaggregate entfernt, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Die Verdauung wurde durch Zugabe von 3 ml minimalem essentiellen Medium (MEM) mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (FBS) beendet. Die Einzelzellsuspensionen wurden dann 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1.000 U/min zentrifugiert. Nach Entfernung des Überstands wurden die Pellets in 1 ml Zellmedium resuspendiert und in einer 25 cm2 großen Zellkulturschale bei 37 °C in einem Inkubator bei 5 % CO2-Atmosphäre und 100 % relativer Luftfeuchtigkeit kultiviert. Nach etwa 3–5 Tagen wanderten die anhaftenden DPSCs von den Pulpagewebestücken nach außen. Kurz gesagt, die isolierten DPSCs wurden in EV-freiem MEM-Basismedium (Wachstumsmedium), das 10 % (v/v) FBS und 1 % (v/v) Antibiotika-Antimykotika-Lösung enthielt, bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO2 kultiviert Atmosphäre und 100 % relative Luftfeuchtigkeit. Das Auffrischen des Mediums erfolgte alle zwei Tage. In den nachfolgenden Versuchen wurden DPSCs der Stadien 3 bis 5 verwendet. Die Induktion der osteogenen Differenzierung wurde durch Kultivierung von DPSCs in osteogenem Differenzierungsmedium, ergänzt mit 0,1 mM Ascorbinsäure, 100 nM Dexamethason und 10 mM β-Glycerophosphat, durchgeführt.

Nach Erreichen einer Konfluenz von etwa 80 % wurden die DPSCs zweimal mit PBS gespült und weitere 24 Stunden in Medium ohne FBS kultiviert. Um Zelltrümmer und alle nicht gebundenen Zellen zu entfernen, wurden die Überstände gesammelt, 15 Minuten lang bei 4 °C unterschiedlich zentrifugiert (300 g, 2.000 g und 5.000 g) und mit einem 0,22-μm-Filter filtriert; das Sediment wurde dann verworfen. Der Überstand wurde dann in ein Ultrazentrifugenröhrchen überführt und zweimal einer Ultrazentrifugation bei 20.000 g für 90 Minuten bei 4 °C unterzogen, um von DPSC abgeleitete EVs zu pelletieren. Die Pellets wurden in 100 μl sterilem PBS resuspendiert, um eine homogene EV-Suspension zu erhalten, und dann zur weiteren Anwendung bei –80 °C gelagert.

Anschließend wurde die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) verwendet, um die quantitative Konzentration und die Partikelgrößenverteilung von DPSC-abgeleiteten Elektrofahrzeugen zu testen. Alle Proben wurden mit PBS auf ein Endvolumen von 1 ml verdünnt. Um die ideale Messkonzentration von 20–100 Partikeln pro Bild zu ermitteln, wurde ein Vortest durchgeführt; siehe Abb. 1a. Die Einstellungen wurden gemäß dem Softwarehandbuch des Herstellers (NanoSight NS300) vorgenommen. Darüber hinaus wurden Morphologie und Größe der isolierten DPSC-EVs mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) beurteilt (Abb. 1b – d). Insgesamt 10 μl DPSC-EVs wurden pelletiert, in 10 μl HEPES-Puffer resuspendiert und für TEM-Beobachtungen auf ein kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter getropft.

Untersuchung der Eigenschaften von DPSC-abgeleiteten Elektrofahrzeugen: Die Anzahl und Größe der Elektrofahrzeuge wurde durch (a) Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) mit NanoSight NS300 analysiert. (b–d) Die Form der Elektrofahrzeuge wurde durch Transmissionselektronenanalyse (TEM) untersucht. e Veranschaulicht die zelluläre Internalisierung von WSA-markierten EVs (rote Fluoreszenz) in DAPI-positive DPSC-Zellen (blaue Fluoreszenz) nach 1 h, 3 h und 8 h.

In dieser In-vitro-Studie wurden kommerziell erhältliche Partikelknochentransplantate (Partikelgröße 0,5–2 mm) verwendet. Wir verwendeten maxresorb (botiss biomaterials GmbH, Deutschland) als biphasisches alloplastisches Calciumphosphat (BCP)-Gerüst. Für das allogene Gerüst verwendeten wir maxgraft (botiss biomaterials GmbH, Deutschland), ein gefriergetrocknetes Knochen-Allotransplantat. Für das xenogene Knochentransplantat verwendeten wir Cerabone (botiss biomaterials GmbH, Deutschland), ein deproteinisiertes Rinderknochenmineral.

Zunächst wurden die isolierten DPSC-abgeleiteten EVs 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einer molekularen Lektinsonde, Wheat Germ Agglutinin Conjugates (WGA, Alexa Fluor 488-Konjugat), fluoreszierend markiert, bevor sie durch 90-minütige Zentrifugation bei 20.000 g beendet und darin resuspendiert wurden PBS. Diese WGA-markierten EVs wurden mit DPSC (5 × 104/konfokale Schale) für verschiedene Zeiten (1 Stunde, 3 Stunden und 8 Stunden) co-kultiviert; Anschließend wurden die Zellen mit PBS gespült und in 4 % Paraformaldehyd fixiert. Anschließend wurde der Zellkern weitere 15 Minuten mit 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (Kat.-Nr. 2381700, Invitrogen, USA) angefärbt. Die zelluläre Aufnahme von WGA-markierten EVs durch DPSCs nach unterschiedlichen Inkubationszeiten wurde mithilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) beobachtet. Darüber hinaus wurden mit der ZEN lite-Software zu verschiedenen Zeitpunkten automatisch 3D-Rekonstruktionsbilder aus WGA- und DAPI-Fluoreszenz erstellt (Abb. 1e).

Nach 7-tägiger Kultivierung wurden die Zellmorphologien auf verschiedenen Knochengerüsten unter EV-Intervention bei einer anfänglichen Dichte von 20.000 Zellen/Schale durch Zytoskelettfärbung und Rasterelektronenmikroskopie (REM) bewertet. Zur Beurteilung der Zytoskelettorganisation wurden die Zellgerüstproben mit EVs vorbehandelt und anschließend zweimal mit PBS gespült und 20 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert, gefolgt von einer Vorbehandlung mit Triton X-100 (0,1 % v/ v) für 5 Min. Die Proben wurden dann mit Rhodamin-Phalloidin (Kat.-Nr. R415, Invitrogen, Deutschland) zur Visualisierung von F-Actin und DAPI (Kat.-Nr. 2381700, Invitrogen, Deutschland) zur Visualisierung der Kerne für 45 Minuten und 5 Minuten gleichzeitig angefärbt , jeweils. Die Probenvisualisierung wurde nach 1 Stunde, 3 Stunden und 8 Stunden über CLSM durchgeführt und Z-Stapelbilder für die 3D-Konstruktion wurden erhalten.

Für SEM-Beobachtungen wurden die Zellgerüstkonstrukte in verschiedenen Gruppen zweimal vorsichtig mit PBS-Puffer gewaschen, 4 Stunden lang mit 2,5 % Glutaraldehyd fixiert und dann mit einer Reihe unterschiedlicher Konzentrationen Ethanol (30 %, 50 %, 70 %, 90 % und zweimal 100 %. Als nächstes wurden Zell-/Gerüstkonstrukte über Nacht nach einem etablierten Protokoll30 getrocknet und dann mit Au/Pd gesputtert und unter Verwendung von SEM (XL30 FEG; FEI, Eindhoven, Niederlande) mit einer Beschleunigungsspannung von 10 kV beobachtet.

Anschließend wurden die mit Zellen ausgesäten BGSs in konfokalen Schalen mit einer Anfangsdichte von 20.000 Zellen/Schale für 3 oder 7 Tage kultiviert. Die Hälfte der Proben wurde einer EV-Stimulation unterzogen (5 × 109 Partikel/ml). Zu jedem vorher festgelegten Zeitpunkt wurde das Medium verworfen und die Zellen wurden dreimal gewaschen. Gemäß den Anweisungen des Herstellers wurden zwei verschiedene Färbungen durchgeführt: (1) Lebendzell-Calcein-AM-Färbung (Kat.-Nr. PK-CA707-30002, PromoKine, Deutschland) und (2) DAPI-Färbung (Kat.-Nr. 2381700, Invitrogen, USU). ). Auf den Knochengerüsten wachsende DPSC-Zellen wurden dreimal gespült und mittels CLSM beobachtet, um den proliferativen Effekt zu bestimmen.

Ein Live/Dead Cell Assay Kit (PromoKine, PromoCell GmbH, Deutschland) wurde verwendet, um die Lebensfähigkeit der Zellen anhand der intrazellulären Esteraseaktivität und der Plasmamembranintegrität von DPSCs zu ermitteln. DPSCs wurden 1, 3, 5 und 7 Tage lang im osteogenen Medium auf die drei verschiedenen Knochentransplantatgerüste (20.000 Zellen/Schale) ausgesät. Anschließend wurden die Gerüste zweimal mit warmem PBS gespült und die Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers 45 Minuten lang mit einem gemischten Fluoreszenzfarbstoff markiert, der 2 μM Calcein AM und 4 μM Ethidiumhomodimer-III (EthD-III) enthielt. Abschließend wurde das Verhältnis von grüner Fluoreszenz zu roter Fluoreszenz mit der ImageJ-Software analysiert. (Kostenlose Java-Software wurde von den National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA bereitgestellt.)

Die Färbung mit alkalischer Phosphatase (ALP) wurde verwendet, um die osteogene Differenzierung in der Früh- und Spätphase in allen Gruppen nach 7 und 14 Tagen Kultivierung zu bewerten. Kurz gesagt, das Kulturmedium wurde abgesaugt und die DPSCs wurden zweimal vorsichtig mit PBS-Puffer gewaschen. Eine Fixierlösung wurde zugegeben und dann bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 5 Minuten wurde die Fixierlösung abgesaugt und ALP-Färbelösung (Kat.-Nr. GR3358974-1, Abcam Co., UK) im Dunkeln zugegeben und weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Beobachtung von ALP-positiven (ALP+) Zellen wurde mittels optischer Mikroskopie durchgeführt und mit der ImageJ-Software analysiert.

Alizarinrot-Färbung (ARS) (Kat.-Nr. 3512879, Merck, Deutschland) wurde verwendet, um die mineralisierte Knötchenbildung der osteogenen Differenzierung in der Spätphase durch Kalziumablagerung zu bestimmen. Nach 14-tägiger osteogener Inkubation wurden die Zellen in verschiedenen Gruppen zweimal mit PBS gespült, 10 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert und dann 25 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur mit 0,1 % ARS-Lösung (40 mM, pH 4,2) gefärbt . Diese mineralisierten Niederschläge wurden mit einem optischen Mikroskop beobachtet und fotografiert und mit der ImageJ-Software analysiert. Die mineralisierten Knötchen erschienen als dunkelrotes Zentrum und als hellroter Randbereich.

Die Analysen wurden mit Prism 7.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA) durchgeführt. Vor der Analyse wurden die Werte anhand der D'Agostino-Pearson- oder Shapiro-Wilk-Testkriterien auf Normalverteilung getestet und bestanden den Brown-Forsythe-Test auf gleiche Varianzen. Eine Zwei-Wege-ANOVA wurde verwendet, um die parametrischen Daten der Gruppen im Hinblick auf zwei verschiedene kategoriale Variablen zu analysieren: Variable eins umfasst das unterschiedliche Knochenmaterial und Variable zwei das Vorhandensein oder Fehlen von EVs. Es wurde ein Post-hoc-Tukey-Mehrfachvergleichstest durchgeführt, bei dem für jeden Vergleich individuelle Varianzen berechnet wurden. Die Daten in diesem Dokument stellen den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dar. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden als signifikant angesehen, wenn p < 0,05.

Die Ausbeute an aus DPSCs erhaltenen EVs hatte eine gemessene Konzentration von 2 × 109 Nanopartikeln/ml. Die Bestätigung der Vesikelgröße und Morphologie der in der hier vorgestellten Studie erhaltenen Elektrofahrzeuge zeigte Ähnlichkeiten mit Werten in der Literatur. Zur Charakterisierung der Elektrofahrzeuge wurden NTA über NanoSight NS300 und TEM verwendet. Die REM-Bilder zeigten, dass die EVs eine typische becherförmige Morphologie mit unterschiedlichen hydrodynamischen Durchmessern aufwiesen (Abb. 1b – d). NTA ergab EVs im Größenbereich von etwa 184,9 ± 67,0 nm. Die REM-Bilder zeigten auch, dass die isolierten Elektrofahrzeuge ähnliche Formen hatten, was zusammen bewies, dass die Isolierungsmethoden zu homogenen Elektrofahrzeugchargen geführt hatten.

Abbildung 1e zeigt die Wechselwirkung der WGA-markierten EVs und DPSCs mit DAPI-gefärbten Kernen. Nach einer Inkubationszeit von 1 Stunde wurden zunächst wenige EVs in das Zytoplasma der DPSCs aufgenommen. In der Nähe der DAPI-gefärbten Kerne waren nur wenige WSA-positive EVs erkennbar. Über die aufeinanderfolgende Dauer von 3–8 Stunden stellten wir eine stetige Aufnahme und zunehmende Anreicherung von EVs im Zytoplasmaraum fest.

In monokultivierten DPSC mit EVs wurde unter dem Einfluss von EVs in allen Knochentransplantatmaterialien eine Fülle von F-Actin-Fasern beobachtet. Die in Abb. 2a – c gezeigten Fluoreszenzbilder zeigen eine homogene Verteilung der Aktinfasern und Filamentverlängerung von DPSCs auf alloplastischen, allogenen und xenogenen BGSs. Morphologisch war kein Unterschied zwischen den Gruppen in der Färbung des Aktins des Zytoskeletts von DPSCs unter dem Einfluss von EVs erkennbar.

(a–c) Zeigt eine homogene Verteilung von Aktinfasern und Filamentverlängerung von DPSC unter dem Einfluss von EVs auf (a) alloplastischen, (b) allogenen und c xenogenen Gerüsten. Die Vergrößerungen der linken Bilder betrugen 400 × und der mittleren Bilder 600 ×. Die Bilder rechts sind 3D-Rekonstruktionen. (d–o) Fotos der Rasterelektronenmikroskopie von Tag 7 der DPSC-Zellkulturen. (d, e) zeigen DPSC auf alloplastischem Gerüst. (f, g) DPSC + EVs auf alloplastischem Gerüst. (h, i) zeigt DPSC auf allogenem Gerüst. (j, k) DPSC + EVs auf allogenem Gerüst. (l, m) zeigen DPSC auf xenogenem Gerüst. (n, o) DPSC + EVs auf xenogenem Gerüst.

REM-Bilder von Tag 7 (Abb. 2) der DPSC-Zellkulturen zeigten normale Formen von MSCs auf den BGSs. Die Zellen auf den alloplastischen (d–g), allogenen (h–k) und xenogenen (l–o) BGSs zeigten eine normale Expansion und eine spindelförmige Morphologie, zunächst mit EVs und zweitens ohne EVs. Die Zellen waren entlang der Oberfläche der Transplantate ausgerichtet und wuchsen in zufälligen Regionen.

Die Lebensfähigkeit von DPSC wurde mit und ohne Stimulation durch EV-Nanopartikel auf verschiedenen BGSs mithilfe eines Calcein-AM-Assays bewertet. Tabelle 1 und Abb. 3 zeigen die Messung der Zellproliferation und -anheftung anhand der Fluoreszenz von Calcein an den Tagen 3 und 7. Die Anzahl der Calcein-AM-positiven (im Folgenden CAM+) Zellen stieg in allen Gruppen von Tag 3 bis Tag 7 an. Darüber hinaus führten DPSCs mit der Anwesenheit von EVs zu beiden Zeitpunkten zu deutlich mehr CAM+-Zellen (p < 0,001). Mit etwa 773,25 ± 5,95 CAM+-Zellen/mm2 wurden nach 7 Tagen die signifikantesten (p < 0,001) CAM+-Zellen in den DPSCs und EVs in den xenogenen BGSs nachgewiesen, im Vergleich zu den alloplastischen BGSs (mit 501,38 ± 6,86 CAM+-Zellen/mm2). ) und allogene BGSs (mit 512,88 ± 15,45 CAM+-Zellen/mm2).

Messung der Zellproliferation und -anheftung durch Calcein AM-Färbung; (a, b) nach 3 Tagen Zellkultur. (c, d) nach 7 Tagen Zellkultur. 50-fache Vergrößerung; ***p < 0,001.

Als nächstes testeten wir die Lebensfähigkeit von DPSC unter dem Einfluss von EVs, die 1, 3, 5 und 7 Tage lang in osteogenem Medium auf alloplastischen, allogenen und xenogenen BGSs kultiviert wurden (Abb. 4). In allen Beobachtungszeiträumen wurden im Lebend/Tot-Assay nur sehr wenige tote Zellen festgestellt, die nicht analog mit der wachsenden Zellzahl lebender Zellen anstiegen. Bei der signifikant höchsten Anzahl von 959 ± 11,81 lebenden Zellen pro mm2 wies die xenogene Gruppe nach 7 Tagen 18,00 ± 1,69 tote Zellen pro mm2 auf. Zu allen vier Zeitpunkten wurde zwischen allen Gruppen kein signifikanter Unterschied in der Anzahl toter Zellen pro mm2 festgestellt.

Grafische Darstellung der Live-and-Death-Bewertung von DPSC + EVs nach (a) 1, (b) 3, (c) 5 und (d) 7 Tagen. ***(p < 0,001); *(p < 0,05). (e–f) Fluoreszenzbilder der Lebend-Tot-Färbung von DPSC + EVs nach 7 Tagen. Linkes Bild 50-fache Vergrößerung; rechtes Bild 100-fache Vergrößerung.

In DPSCs wurde die ALP-Aktivität nach 7- und 14-tägiger Behandlung mit EV und ohne EV-Stimulation als früher Indikator für die Zelldifferenzierung in Richtung der osteogenen Linie bestimmt. Im Vergleich zu DPSC ohne EVs erhöhten EVs die ALP-Aktivität in allen BGS nach 7 Tagen Kultur signifikant (p < 0,001) (Tabelle 2 und Abb. 5a,b). Der höchste Anteil der 40,85 ± 5,63 % der ALP+-Fläche wurde in DPSC-EVs gefunden, die auf xenogenem BGS kultiviert wurden. Nach 14 Tagen zeigten alle EV-Gruppen einen signifikanten Anstieg der ALP-Aktivität im Vergleich zu DPSCs ohne EVs. Auch hier zeigten DPSCs auf dem xenogenen Gerüst die höchste ALP-Aktivität in der Gruppe ohne EVs mit einer ALP+-Fläche von 39,81 ± 2,88 % (p < 0,001) und auch in der Gruppe der DPSCs + EVs mit einer ALP+-Fläche von 44,85 ± 1,25 % , der mit einer ALP+-Fläche von 31,83 ± 2,50 % signifikant höher war (p < 0,001) als die DPSC + EVs des alloplastischen Transplantats (Tabelle 2 und Abb. 6a, b). Alizarinrot-Färbung (ARS) und Von-Kossa-Färbung wurden durchgeführt, um die späte Phase der osteogenen Differenzierung nach 14 Tagen zu bewerten. Analog zur ALP-Färbung wurde auch in allen BGS-Materialien eine deutlich erhöhte ARS+-Fläche unter dem Einfluss von EVs gefunden. Dieser Effekt war besonders deutlich in xenogenem BGS-Material zu erkennen. Ohne EVs betrug der ARS+-Bereich 13,04 ± 1,02 %, und mit EVs stieg der Prozentsatz signifikant (p < 0,001) auf einen ARS+-Bereich von 34,53 ± 1,22 % (Tabelle 2 und Abb. 7a,b).

(a) Bilder der ALP-Färbung nach 7 Tagen. 100-fache Vergrößerung. (b) Grafische Darstellung der APL-Bewertung nach 7 Tagen. ***(p < 0,001); *(p < 0,05).

(a) Bilder der ALP-Färbung nach 14 Tagen. 100-fache Vergrößerung. (b) Grafische Darstellung der APL-Bewertung nach 14 Tagen. ***(p < 0,001); *(p < 0,05).

(a) Bilder der ARS-Färbung nach 14 Tagen. 100-fache Vergrößerung. (b) Grafische Darstellung der ARS-Bewertung nach 14 Tagen. ***(p < 0,001); *(p < 0,05).

Über das therapeutische Potenzial MSC-abgeleiteter Elektrofahrzeuge wurde bereits ausführlich berichtet9,12,15,23,25,28,31. Sowohl In-vivo- als auch In-vitro-Studien haben ausreichend gezeigt, dass viele Schlüsselfaktoren des Knochenumbaus durch die regulatorische Wirkung von MSC-abgeleiteten EVs gesteuert werden9,19,23,25.

In dieser Studie konzentrierten wir uns auf MSCs, die aus Zahnmarkgewebe isoliert wurden. Es wurden menschliche DPSC-EVs extrahiert und wir verglichen die Interaktion sowie die osteogene Differenzierung menschlicher DPSCs unter dem Einfluss von EVs in verschiedenen Knochengerüsten, um einerseits die Rolle von aus DPSCs abgeleiteten EVs und andererseits den Einfluss verschiedener Knochenersatzstoffe besser zu verstehen die therapeutische Wirkung von DPSCs andererseits. Alle Gerüste waren in der Lage, DPSC zu tragen, und alle von uns getesteten DPSCs waren in der Lage, die hinzugefügten EVs in vitro zu integrieren. Während der TEM-Untersuchung zeigten die DPSCs in alloplastischen, allogenen und xenogenen Gerüsten mit und ohne EVs eine normale Form und es wurden keine morphologischen Unterschiede beobachtet. Ebenso zeigten die monokultivierten DPSCs mit EVs eine homogene Verteilung der Aktinfasern und Filamentverlängerung auf allen in der Studie verwendeten Knochenersatzmaterialien.

Die allgemeine Fähigkeit von DPSCs, Elektrofahrzeuge zu internalisieren, war ein wichtiger Aspekt dieser Studie, was darauf hindeutet, dass die Aufnahme von Elektrofahrzeugen mit den von uns beobachteten Auswirkungen von DPSCs zusammenhängt. Viele Studien haben miRNAs25, Oberflächenproteine und Glykoproteine sowie die zellspezifischen Wege der EV-Internalisierung bereits ausreichend untersucht32. Es ging über den Rahmen dieser Studie hinaus, die Effizienz der Internalisierung unserer EVs zu bestimmen oder die einzelnen miRNAs, Oberflächenproteine und Glykoproteine der zellspezifischen Aufnahmewege auf der EV-Oberfläche zu identifizieren und experimentell zu bestätigen. Unsere Studie konzentrierte sich hauptsächlich auf die qualitative Aufnahme der extrahierten Elektrofahrzeuge in die DPSCs. Qualitative Untersuchungen, ob Elektrofahrzeuge in Zielzellen internalisiert werden können, wurden bereits von anderen Forschern durchgeführt25,32. Über die Dauer von 8 Stunden beobachteten wir in unseren Experimenten eine stetige Internalisierung und Akkumulation von fluoreszierend WGA-markierten EVs in die DPSCs mit DAPI-gefärbten Kernen über CLSM. In Anbetracht der Ergebnisse der Proliferations- und Differenzierungsexperimente können wir davon ausgehen, dass die EVs effizient genug in die DPSCs internalisiert wurden.

Laut Mondal et al.32 ist die Isolierung von Elektrofahrzeugen ein wichtiger Schritt für die Erforschung dieser Vesikel. Obwohl frühere Untersuchungen Nachteile wie den längeren Zeitaufwand und die potenzielle Proteinkontamination beschrieben haben, die für die Reinigung von Elektrofahrzeugen durch Ultrazentrifugation erforderlich sind32, haben wir bei unseren Nano-Tracking-Studien oder bei der SEM-Untersuchung keine starke Kontamination durch nicht-vesikuläre Proteine beobachtet. Die Heterogenität der EV-Größen ist ein natürliches Phänomen, das auf verschiedenen interzellulären Signalmechanismen von Zellen basiert33. Frühere Studien haben die heterogenen Größen von Elektrofahrzeugen zwischen 30 und 200 nm beschrieben9,25,32. Im Einklang mit dieser früheren Arbeit wurden in unserer Studie mittels Nano-Tracking-Analyse EVs im Größenbereich von etwa 184,9 ± 67,0 nm bestimmt. Die morphologische Auswertung von Elektrofahrzeugen mittels REM-Untersuchung zeigte auch, dass die isolierten Elektrofahrzeuge trotz ihrer heterogenen Größe in ihrer morphologischen Form identisch waren.

Die Behandlung kraniofazialer Knochendefekte34 und eine unzureichende Knochenversorgung des Kiefers stellen Therapeuten vor große Herausforderungen3,35. Obwohl reine Knochenersatzstoffe autologem Knochen hinsichtlich der Entnahmemorbidität überlegen sind36, weisen sie erhebliche Mängel hinsichtlich Osteogenese, Osteoinduktion und Osteokonduktion auf3. Daher wird intensiv nach alternativen Methoden gesucht, um die osteogenen Eigenschaften von BGSs3,7,35,37 zu verbessern. Re et al.13 beschrieben eine verbesserte Knochenregeneration von Knochenersatzstoffen, wenn den Gerüsten MSCs und abgeleitete EVs hinzugefügt wurden. Unsere Untersuchungen zu DPSCs wurden an alloplastischen, allogenen und xenogenen Knochentransplantaten durchgeführt. Den Erkenntnissen von Re et al.13 zufolge waren alle in der vorliegenden Studie untersuchten Gerüste in der Lage, DPSCs zu tragen, und der Einfluss von EVs führte zu einer erhöhten Induktion der osteoblastischen Differenzierung. Dennoch wurden signifikante Unterschiede im Ausmaß der Zellproliferation, der Zellanhaftung und der osteogenen Differenzierung unter dem Einfluss von EVs sowie in der Abhängigkeit der BGSs beobachtet.

Die Calcein-AM-Färbung, die die intrazelluläre Esteraseaktivität anzeigt, ist eine etablierte Methode zur Beurteilung der Lebensfähigkeit von DPSCs31,35. In unseren Experimenten haben wir gezeigt, dass DPSCs unter dem Einfluss von EVs, die 3 bzw. 7 Tage lang auf xenogenen Gerüsten gezüchtet wurden, eine signifikant höhere Anzahl an anhaftenden und proliferierten DPSCs aufwiesen, mit bis zu 773,25 ± 5,95 CAM+-Zellen/mm2 (p < 0,001). im Vergleich zu allen anderen Gruppen. Diese Beobachtung steht im Einklang mit der Arbeit von Zhang et al.31, die in einer In-vivo-Studie eine erhöhte Anzahl von Calcein-positiven MSCs in Gegenwart von EVs beschrieben, die mit xenogenem Knochenmaterial mit einer EV-Konzentration von 1 × 1012 Nanopartikeln/ml verwendet wurden im Vergleich zu einem signifikant verringerten Calcein-positiven Knochen in Abwesenheit von EVs. Wir verwendeten in unserer Studie eine geringere Menge an Elektrofahrzeugen (2 × 109 Nanopartikel/ml), aber trotz dieser geringeren Konzentration an Elektrofahrzeugen beobachteten wir einen hochsignifikanten (p < 0,001) Effekt auf die Zelllebensfähigkeit von DPSCs unter der Stimulation von Elektrofahrzeugen. Während im Lebend-/Tod-Assay die Anzahl lebender DPSCs mit EVs auf dem xenogenen Gerüst (959 ± 11,81 lebende Zellen/mm2) im Vergleich zu allen anderen Gruppen signifikant höher war (p < 0,001), wurde mit 1,88 % kein Unterschied festgestellt tote Zellen im Vergleich zum Prozentsatz toter Zellen mit dem alloplastischen Gerüst (1,74 %) bzw. dem allogenen Gerüst (2,28 %). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass EVs und xenogene BGSs die Anlagerung und Verbreitung von DPSCs begünstigen, dass jedoch kein Unterschied in der Biokompatibilität zwischen den einzelnen Materialien und dem Einfluss von EVs besteht.

Motamedian et al.29 berichteten über einen signifikanten Effekt verschiedener BGS auf die In-vitro-Zelldifferenzierung von DPSC. Durch die Auswertung der osteogenen Differenzierung mittels APL-Färbung wurde dieser Effekt in unseren Studien bestätigt. Im Vergleich zum alloplastischen Gerüst zeigte die DPSC-Kultur auf den xenogenen BGSs nach 7 Tagen und nach 14 Tagen eine signifikant höhere ALP-Aktivität mit einer ALP+-Fläche von 9,96 ± 0,92 (p < 0,05) und einer ALP+-Fläche von 39,81 ± 2,88 % (p < 0,001). ), jeweils. Im Gegensatz zu unseren Ergebnissen wurde in der Literatur ein günstiger Effekt auf die Differenzierung von DPSCs durch gefriergetrocknetes Knochen-Allotransplantat beschrieben29, wohingegen die Daten unserer Studie gezeigt haben, dass das xenogene Knochenmaterial den alloplastischen und autogenen Gerüsten in Bezug auf diese überlegen war der osteogenen Differenzierung von DPSCs. Dieses Phänomen kann möglicherweise durch die Verwendung unterschiedlicher BGS zwischen den Studien erklärt werden, die unterschiedlich gewonnen wurden und sich in der chemischen Zusammensetzung unterschieden. Dieser Prozess sollte für die zukünftige Auswahl eines geeigneten BGS in weiteren klinischen In-vivo-Untersuchungen standardisiert werden. In einer Vergleichsstudie wurde bei MSCs unter dem Einfluss von EVs eine signifikant erhöhte ALP-Aktivität nach 14 Tagen im Vergleich zur Behandlung mit einem osteogenen Medium in vitro festgestellt25. Analog wurde in der DPSC-Gruppe auf dem xenogenen BGS unter dem Einfluss von EVs ein Anstieg der ALP-Aktivität um 5,04 % beobachtet, was nach einem Beobachtungszeitraum von 14 Tagen die stärkste osteogene Differenzierung unter allen Gerüstgruppen zeigte.

Da sich die Forscher im Zusammenhang mit Knochendefekten und osteoporotischen Erkrankungen hauptsächlich auf die Nutzung von EVs aus MSCs aus dem Knochenmark und deren biologisch aktivem Gehalt konzentriert haben31,38, mangelt es auf diesem Gebiet an Kenntnissen über die Verwendung von DPSCs als alternative Zellquellen zur Gewinnung von EVs haben das osteogene Potenzial, die Knochenmineralbildung zu fördern. Aber Elektrofahrzeuge haben auch das Potenzial, die Stammzelldifferenzierung zu verbessern, da sie unter anderem die Knochenmineralablagerung beschleunigen können9,31,39. Zhang et al.31 haben einen höheren Prozentsatz an ARS+-Zellen im xenogenen Knochen in Gegenwart von EVs nach 8 Wochen Knochenheilung beschrieben. In Übereinstimmung mit ihren Ergebnissen haben unsere Daten einen signifikanten Anstieg der ARS+-Zellen durch das Vorhandensein von Elektrofahrzeugen in allen Gruppen nach 21 Tagen gezeigt. Im Vergleich zu allen Gerüsten mit und ohne EV-Intervention zeigten die auf dem xenogenen Gerüst gewachsenen DPSC-EVs in der Spätphase eine deutlich erhöhte osteogene Differenzierung mit einem Anstieg von 21,45 % ARS+-Zellen.

Innerhalb der Grenzen einer In-vitro-Studie zeigen die Daten aus der vorliegenden Arbeit, dass die Wirkung extrazellulärer Vesikel (EVs) auf die Zellproliferation, Zellanhaftung und osteogene Differenzierung von Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs), die auf xenogenen Gerüsten kultiviert werden, deutlich überlegen ist zu dem anderer Knochentransplantate (BGSs). Die einfache Gewinnung von DPSCs und die zuverlässige Isolierungsmethode von EVs in Kombination mit den synergistischen osteogenen Differenzierungsraten belegen ihre Eignung für zukünftige Knochengewebe-Engineering-Studien. Eine weitere Untersuchung der Ergebnisse dieser Studie zu den entsprechenden Knochenersatzstoffen sowie den osteogenen Eigenschaften von DPSCs unter dem Einfluss von EVs auf die Knochenregeneration sollte in zukünftigen Studien an lebenden Organismen in Form von Tierversuchen erfolgen.

Alle für diese Studie generierten Daten sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

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Die Autoren bedanken sich für die Nutzung der Geräte und Einrichtungen der interdisziplinären Arbeit. Zentrum für Klinische Forschung der Medizinischen Fakultät der RWTH Aachen. Wir danken botiss biomaterials (botiss biomaterials GmbH, Deutschland) für die kostenlose Bereitstellung der Knochentransplantate.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL. Gefördert durch ein Stipendium des Interdisziplinären Zentrums für Klinische Forschung der Medizinischen Fakultät der RWTH Aachen (OC1-8).

Abteilung für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie, Universitätsklinikum der RWTH Aachen, Pauwelsstraße 30, 52074, Aachen, Deutschland

Marius Heitzer, Philipp Winnand, Frank Hölzle & Ali Modabber

Abteilung für Orthopädie, Unfall- und Wiederherstellungschirurgie, Universitätsklinikum der RWTH Aachen, Pauwelsstraße 30, 52074, Aachen, NRW, Deutschland

Qun Zhao, Johannes Greven, Xing Zhang, Felix Marius Bläsius & Frank Hildebrand

Institut für Pathologie, Universitätsklinikum der RWTH Aachen, Pauwelsstraße 30, 52074, Aachen, NRW, Deutschland

Eva Miriam Buhl & Sabine Neuss

Abteilung für Kieferorthopädie, Universitätsklinikum der RWTH Aachen, Pauwelsstraße 30, 52074, Aachen, NRW, Deutschland

Michael Wolf

BioInterface Group, Helmholtz-Institut für Biomedizinische Technik, RWTH Aachen, Pauwelsstraße 20, 52074, Aachen, NRW, Deutschland

Sabine Neuss

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MH: Konzeption und Design, Durchführung der Experimente, Datenerfassung, Analyse und Interpretation, Entwurf der Arbeit, endgültige Genehmigung; QZ: durchgeführte In-vitro-Experimente, Datenbeschaffung, Überarbeitung der Arbeit, endgültige Genehmigung; JG: Konzeption und Design, Analyse und Interpretation, Endabnahme; PW: Datenbeschaffung, Überarbeitung der Arbeit, endgültige Genehmigung; XZ: durchgeführte In-vitro-Experimente, Datenbeschaffung, Überarbeitung der Arbeit, endgültige Genehmigung; FMB: Konzeption und Design, Überarbeitung der Arbeiten, Endabnahme; EMB: Analyse und Interpretation, Überarbeitung der Arbeit, endgültige Genehmigung; MW: Konzeption und Design, Analyse und Interpretation, Entwurf der Arbeit, endgültige Genehmigung; SN: Analyse und Interpretation, Überarbeitung der Arbeit, endgültige Genehmigung; F.Hi.: Konzeption und Design, Analyse und Interpretation, Überarbeitung der Arbeit, endgültige Genehmigung; F.Ho.: Konzeption und Design, Überarbeitung der Arbeit, Endabnahme; AM: Konzeption und Design, Analyse und Interpretation, Überarbeitung der Arbeit, endgültige Genehmigung; und alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Qun Zhao.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Heitzer, M., Zhao, Q., Greven, J. et al. Bewertung der In-vitro-Biokompatibilität menschlicher Pulpastammzellen mit allogenen, alloplastischen und xenogenen Transplantaten unter dem Einfluss extrazellulärer Vesikel. Sci Rep 13, 12475 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39410-0

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Eingegangen: 26. Mai 2023

Angenommen: 25. Juli 2023

Veröffentlicht: 01. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39410-0

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