Entwicklung neuartiger Breiten

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 4104 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Bakterielle Resistenzen gegen Antibiotika sind ein großes globales Gesundheitsproblem. Trotz eines steigenden Bedarfs wurden in den letzten Jahrzehnten nur sehr wenige neuartige antimikrobielle Wirkstoffe und Therapien für den klinischen Einsatz bereitgestellt. Antimikrobielle Peptide wurden intensiv untersucht, und viele davon haben sich in vitro als vielversprechend erwiesen. Wir haben zuvor gezeigt, dass das Bakteriozin Plantaricin NC8 αβ (PLNC8 αβ) aus Lactobacillus plantarum Staphylococcus spp. wirksam hemmt und wenig bis gar keine Zytotoxizität gegenüber menschlichen Keratinozyten zeigt. Aufgrund seiner Einschränkungen bei der Hemmung gramnegativer Spezies bestand das Ziel der vorliegenden Studie jedoch darin, neue antimikrobielle peptidomimetische Verbindungen mit einem erweiterten Aktivitätsspektrum zu identifizieren, die vom β-Peptid von PLNC8 αβ abgeleitet sind. Wir haben eine kleine Bibliothek von Lipopeptiden mit deutlich verbesserter antimikrobieller Aktivität sowohl gegenüber grampositiven als auch gramnegativen Bakterien, einschließlich der ESKAPE-Krankheitserreger, rational entworfen und synthetisiert. Die Lipopeptide bestehen aus 16 Aminosäuren mit einer endständigen Fettsäurekette und bilden Mizellen, die Bakterien wirksam hemmen und abtöten, indem sie ihre Zellmembranen durchlässig machen. Sie zeigen eine geringe hämolytische Aktivität und Liposomenmodellsysteme bestätigen die Selektivität für bakterielle Lipidmembranen. Die Kombination von Lipopeptiden mit verschiedenen Antibiotika verstärkte die Wirkung synergistisch oder additiv. Unsere Daten deuten darauf hin, dass die neuartigen Lipopeptide als zukünftige antimikrobielle Wirkstoffe vielversprechend sind. Allerdings sind zusätzliche Experimente mit relevanten Tiermodellen erforderlich, um ihre In-vivo-Wirksamkeit weiter zu validieren.

Antibiotika sind die wirksamste Behandlung gegen bakterielle Infektionen sowohl grampositiver als auch gramnegativer Spezies. Viele Arten sind opportunistische Krankheitserreger, die im Zusammenhang mit chronischen Wunden und medizinischen Geräten, z. B. Kathetern und prothetischen Implantaten, beim Menschen schwere Infektionen verursachen können1. Diese bakteriellen Ansammlungen sind die Grundlage für anhaltende Infektionen, die im Allgemeinen schwer zu behandeln sind, was das Risiko einer bakteriellen Verbreitung und der Entwicklung systemischer Komplikationen erhöht2,3. Angesichts der allmählichen Zunahme der Antibiotikaresistenz kann es außerdem noch schwieriger werden, eine Behandlung zu erreichen, da die verfügbaren Optionen immer begrenzter werden4. Daher sind neue Ansätze und innovative Alternativbehandlungen gegen bakterielle Infektionen dringend erforderlich. Antimikrobielle Peptide (AMPs) stellen eine der vielversprechendsten Klassen antimikrobieller Substanzen dar und sind eine ergiebige Quelle für die Entwicklung hochwirksamer neuer Therapeutika5,6.

Da Antibiotika immer weniger wirksam sind, sind AMPs aufgrund ihrer antimikrobiellen Eigenschaften zu attraktiven Kandidaten in der Humanmedizin geworden. Viele AMPs zeigen eine geringe Toxizität gegenüber eukaryotischen Zellen und Aktivität gegen pathogene Bakterien, die Resistenzen gegen Antibiotika entwickelt haben5,7. Diese Peptide bestehen im Allgemeinen aus kurzen Sequenzen (< 100 Aminosäuren) ohne geordnete Sekundärstruktur in Lösung. Sie sind typischerweise sehr hitzestabil, tolerieren pH-Änderungen und zeigen eine bakterizide Wirkung gegen eine Vielzahl von Mikroben8,9,10,11. Bakteriozine sind eine heterogene Gruppe von AMPs, die von mehreren verschiedenen Bakterien produziert werden. Sie können sowohl ein schmales als auch ein breites Spektrum haben, und mehrere Bakteriozine weisen eine starke antibakterielle Aktivität und eine geringe Toxizität für tierische Zellen auf5. Wir haben zuvor gezeigt, dass das Bakteriozin PLNC8 αβ den gramnegativen oralen Krankheitserreger Porphyromonas gingivalis permeabilisiert und seine zytotoxischen und immunmodulatorischen Wirkungen auf menschliche Zellen hemmt12,13. Darüber hinaus haben wir kürzlich gezeigt, dass PLNC8 αβ am wirksamsten gegen Bakterien der Gattung Staphylococcus ist, einschließlich Stämmen, die Resistenzen gegen Antibiotika entwickelt haben, und die Aktivität verschiedener Antibiotika um ein Vielfaches steigert14.

Die problematischsten und krankheitserregendsten Bakterien wurden von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) kategorisiert und umfassen Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa und Enterobacter-Arten (ESKAPE). Diese Bakterien haben eine Multiresistenz gegen mehrere Antibiotikaklassen entwickelt und können Biofilme bilden. Die WHO hat die ESKAPE-Krankheitserreger zu den 12 Krankheitserregern mit der höchsten Priorität für die Entwicklung neuer antimikrobieller Mittel gezählt. Die meisten Antibiotika, die in den Leitlinien des Clinical & Laboratory Standards Institute zur Bekämpfung der ESKAPE-Erreger empfohlen werden, wurden aus den Leitlinien gestrichen, und an ihrer Stelle wurden nur sehr wenige neuartige Antibiotika oder Antibiotikakombinationen hinzugefügt15. Da durch die ESKAPE-Erreger verursachte Infektionen die problematischsten Infektionen beim Menschen sind, ist es wichtig, alternative Behandlungsmethoden zu finden, die auf neuartigen antimikrobiellen Verbindungen basieren. Die Wirksamkeit und geringe Toxizität neuer und innovativer Substanzen kann möglicherweise den Gesamteinsatz von Antibiotika reduzieren und folglich kann die Entwicklung und Ausbreitung antimikrobieller Resistenzen durch den Einsatz von AMPs entweder allein oder in Kombination mit niedrigen Antibiotikadosen unterdrückt werden.

AMPs werden seit Jahrzehnten intensiv untersucht. Während sich zahlreiche Verbindungen in vitro als hochwirksam erwiesen haben, zeigten die meisten bei der Untersuchung in komplexeren Umgebungen Einschränkungen wie die Anfälligkeit gegenüber Proteasen und die Hemmung der Aktivität in Gegenwart von Salzen oder Kationen oder bei pH-Änderungen16 ,17. Fortschritte auf dem Gebiet der Arzneimittelentwicklung und der antimikrobiellen Peptidmimetika ermöglichen nun jedoch die Entwicklung von AMP-Mimetika mit verbesserter Proteasestabilität, geringerer Toxizität und höherer antimikrobieller Aktivität und bieten somit Möglichkeiten, diese Einschränkungen zu umgehen18,19.

Vor diesem Hintergrund haben wir eine sorgfältige und systematische Optimierung und Charakterisierung einer neuen Klasse von peptidomimetischen Verbindungen entworfen und durchgeführt, die von Plantaricin NC8β abgeleitet sind, mit dem Ziel, neue antimikrobielle Verbindungen mit geringer Toxizität und verbesserter antimikrobieller Aktivität für ein breiteres Spektrum zu identifizieren Bakterienarten, mit Schwerpunkt auf zukünftigen topischen Anwendungen. Wir zeigen, dass mehrere dieser neuen Verbindungen, die aus 16 Aminosäuren mit einer kurzen terminalen Fettsäurekette (FA) bestehen, eine signifikante antibakterielle Aktivität und eine geringe hämolytische Aktivität gegenüber menschlichen Erythrozyten aufweisen. Die Lipopeptide zeigen eine höhere Affinität zu Lipiddoppelschichten, die Bakterienmembranen nachahmen, als zu Zellmembranen, die Säugetieren nachahmen, was sie zu interessanten Kandidaten für weitere Forschung macht. Darüber hinaus schlagen wir vor, dass der in dieser Studie entwickelte systematische Designansatz die Entwicklung neuartiger antimikrobieller Verbindungen ermöglicht, bei denen mehrere der inhärenten Einschränkungen antimikrobieller Peptide umgangen werden können.

S. aureus (ATCC 29213, MSSA, ATCC, Manassas, VA), E. coli (K-12 MG1655) und klinische Isolate von S. aureus, E. coli, E. faecium, K. pneumoniae, A. baumannii, P .aeruginosa und E. cloacae, erhalten von der Abteilung für Labormedizin des Universitätskrankenhauses Örebro, wurden auf Luria-Bertani (LB)-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Einzelne Kolonien wurden in 5 ml LB-Brühe inokuliert und über Nacht auf einem Schüttler (400 U/min) bei 37 °C inkubiert. Die Bakterienkonzentrationen wurden anhand der Lebendzahl bestimmt und so angepasst, dass sie etwa 109 KBE/ml entsprechen. Resistenzmuster für die klinischen Isolate finden Sie in der Ergänzungstabelle S1.

Die Sequenz von PLNC8 β der beiden Peptidbakteriozine PLNC8 αβ wurde verwendet, um neue und optimierte antimikrobielle Peptide zu entwerfen. Die antimikrobielle Aktivität von Volllängen- und verkürzten Peptiden von PLNC8 β wurde mithilfe der Server AntiBP20 und ADAM21 vorhergesagt. Die Sequenz mit der höchsten Punktzahl der vorhergesagten antimikrobiellen Aktivität wurde zur Generierung neuer Varianten verwendet. Peptideigenschaften wie der isoelektrische Punkt, die Nettoladung bei pH 7 und der Prozentsatz hydrophober, saurer, basischer und neutraler Reste wurden mithilfe von Peptide 2.0 (Custom Peptide Synthesis (peptide2.com)) bestimmt. Eine theoretische Annahme der Peptidstruktur wurde mit dem PEP-FOLD-Tool22,23 im RPBS-Webportal24 vorhergesagt. Alle Sequenzen, die Eigenschaften antimikrobieller Peptide aufweisen, wurden synthetisiert und gegen grampositive (S. aureus) und gramnegative (E. coli) Bakterien getestet.

Alle Peptide und Lipopeptide wurden mithilfe der Fmoc-Chemie auf einem automatisierten Mikrowellen-Peptidsynthesizer (Liberty Blue, CEM) im 25–250 μM-Maßstab synthetisiert. ProTide Rinkamid (LL)-Harz wurde als fester Träger für alle Synthesen verwendet, was zu einem amidierten C-Terminus führte. Die Peptide LL-37 und PLNC8 β mit einer freien Säure am C-Terminus wurden auf einem Cl-MPA ProTide (LL)-Harz unter Verwendung von wasserfreiem KI (0,125 M) und DIEA (1 M) in DMF synthetisiert, um die erste Fmoc-geschützte Aminogruppe anzubinden Säure (5 Äq.). Die Reaktion wurde zweimal 10 Minuten lang bei 90 °C unter Mikrowellenbedingungen durchgeführt. Für alle Peptide wurden Fmoc-geschützte Aminosäuren sequentiell unter Verwendung eines fünffachen Überschusses an Aminosäure, Oxyma als Base und DIC als Kopplungsreagenz in DMF unter Mikrowellenbedingungen gekoppelt. Die Fmoc-Entschützung wurde durch Behandlung mit 20 % Piperidin in DMF unter Mikrowellenbedingungen erreicht. Nach der abschließenden Fmoc-Entschützung wurde die N-terminale Modifikation durch Behandlung des harzgebundenen Peptids mit Essigsäureanhydrid in DMF (1:1) zur Acetylierung oder mit n-Alkansäuren (10 Äq.) kombiniert mit HCTU (10 Äq.) und DIEA erreicht (20 Äq.) in DMF zur Lipidierung. Die globale Schutzgruppenentfernung und Abspaltung der Peptide vom Harz wurde durch 3-stündige Behandlung mit TFA:TIS:H2O (95/2,5/2,5, v/v/v) vor der Konzentration unter Verwendung eines Stickstoffstroms erreicht. Die Rohpeptide wurden zweimal in eiskaltem Diethylether ausgefällt und der Ether verworfen. Die Rohpeptide wurden auf einem semipräparativen HPLC-System (Dionex), das mit einer RP C-18-Säule (ReproSil Gold) ausgestattet war, unter Verwendung eines wässrigen Gradienten von Acetonitril mit 0,1 % TFA gereinigt. Die Reinheit wurde mithilfe einer analytischen Säule (C-18, Supelcosil) kontrolliert, die an dasselbe HPLC-System angeschlossen war (ergänzende Abbildung S1), und die Peptididentität wurde mithilfe eines Maldi-ToF-Massenspektrometers (Bruker) bestätigt (ergänzende Abbildung S2).

Liposomen wurden durch die Dünnschicht-Hydratationsmethode hergestellt. Lipid-Stammlösungen (10 mg/ml in Chloroform, Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, USA) der Lipide 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC), 1-Palmitoyl-2 -Oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin (POPS), 1-Hexadecanoyl-2-(9Z-Octadecenoyl)-sn-Glycero-3-phosphoglycerin (POPG) und Cholesterin (Chol) wurden eingesetzt. Bakterienliposomen wurden mit einem POPC:POPG-Verhältnis von 75:25 und Säugetierliposomen mit einem POPC:POPS:Chol-Verhältnis von 65:5:30 hergestellt. Lipidlösungen wurden gründlich homogenisiert und das Lösungsmittel mit trockenem N2-Dampf verdampft, um einen Lipidkuchen zu ergeben. Eine vollständige Trocknung wurde durch eine Inkubation über Nacht in einem Vakuumexsikkator erreicht. Anschließend wurde der Lipidfilm mit einer 5(6)-CF-Lösung (50 mM CF, 10 mM PBS, 90 mM NaCl, pH 7,4) hydratisiert. Nach einer 10-minütigen Inkubation auf einem Orbitalschüttler (50 min−1) wurde die Lösung 60 s lang bei mittlerer Geschwindigkeit gevortext. Es wurde ein Mini-Extruder (Avanti Polar Lipids, Inc., USA) verwendet und 21 Extrusionen wurden durch eine 0,1-µm-Filtermembran (Nuclepore Track-Etched Hydrophilic Membrane, Cytiva, Whatman, MA, USA) durchgeführt, was zu monodispersen unilamellaren Liposomen führte . Unmittelbar vor der Verwendung wurden die Liposomen durch Filtration durch eine Gelfiltrationssäule (PD Minitrap G-25-Säule, Cytiva, USA) gegen PBS-Puffer (10 mM, pH 7,4) von nicht eingekapseltem CF gereinigt.

Die Peptid- und Lipopeptidaktivität gegenüber Liposomenmodellen wurde mithilfe eines Carboxyfluorescein (CF)-Freisetzungstests bewertet. Liposomen wurden in PBS (10 mM, pH 7,4) auf eine endgültige Lipidkonzentration von 25 µM verdünnt und mit Peptiden (10–5–102 µM) in einer 96-Well-Platte (n = 3) inkubiert. Die CF-Freisetzung wurde 1 Stunde lang alle 2,5 Minuten mit einem Infinite M1000 PRO-Plattenlesegerät überwacht. Eine vollständige (100 %) CF-Freisetzung wurde durch Zugabe von 1 % Triton X-100-Lösung und anschließende 10-minütige Inkubation erreicht. Der Prozentsatz der CF-Freisetzung wurde gemäß der Formel 100 * (F − F0)/(FT − F0) bewertet, wobei F die momentane Fluoreszenz, FT die Gesamtfluoreszenz und F0 die Hintergrundfluoreszenz vor der Peptidzugabe angibt. Die Daten wurden mit MATLAB R2019a (The MathWorks Inc., Natick, Massachusetts, USA) an eine Hill-1-Kurve angepasst und die halbe maximale effektive Konzentration (EC50) extrahiert.

Zirkulardichroismus (CD)-Spektroskopie wurde verwendet, um die Struktur von Peptiden bei Wechselwirkung mit Lipidmembranen zu bestimmen. Es wurde ein Chirascan (Applied Photophysics, Leatherhead, Vereinigtes Königreich) verwendet und die Messungen wurden mit einer Quarzküvette mit 1 mm Lichtweg bei Umgebungstemperatur im Wellenlängenbereich 195–280 nm (0,5-nm-Schritte) durchgeführt. Bakterielle membranähnliche Liposomen (POPC:POPG 75:25) wurden wie zuvor beschrieben in PBS-Puffer (10 mM, pH 7,4) hergestellt. Die Lipopeptide L-6-C5 und L-6-C5-Leu wurden mit Liposomenlösung gemischt und 30 Minuten lang inkubiert. In allen Experimenten betrug die Peptidkonzentration 30 µM und die Lipidkonzentration 1,2 mM. Für jede Probe wurden drei Scans aufgezeichnet und die Ergebnisse mit PBS-Puffer (10 mM, pH 7,4) grundlinienkorrigiert. Die Kurven wurden mit MATLAB R2019a (The MathWorks, Inc., Natick, Massachusetts, USA) analysiert und mit einem Savitzky-Golay-Filter geglättet.

Die Lipopeptidaggregation wurde auf einer ALV/CGS-8F-Plattform (ALV-GmbH, Langen, Deutschland) bewertet, die mit einem 632,8 mm He-Ne-Laser ausgestattet war. Streulicht wurde bei 90° gesammelt. Als Puffer wurde PBS (10 mM, pH 7,4) gewählt und vor der Verwendung mit einem 0,22-µm-Filter filtriert. Die Proben wurden in einer zylindrischen Glasküvette vorbereitet, die in Toluol mit passendem Brechungsindex getaucht war. Die Peptide wurden seriell zwischen 100 µM und 0,01 nM verdünnt, 1 Minute lang beschallt und vor der Messung 5 Minuten lang bei 22 °C inkubiert und verwirbelt. Die Temperatur wurde während des gesamten Experiments mithilfe eines zirkulierenden Wasserbads kontrolliert. Die Daten wurden mit der Software ALV-Correlator (Version 3.0, ALV-GmbH, Langen, Deutschland) analysiert und die Streuintensität durch durchschnittlich 10 aufeinanderfolgende 30-s-Läufe ermittelt.

Zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MIC) und der minimalen bakteriziden Konzentration (MBC) wurde die Bouillon-Mikroverdünnungsmethode gemäß den EUCAST-Standards für die Bouillon-Mikroverdünnungsmethode verwendet. Es wurden zweifache Reihenverdünnungen der Lipopeptide verwendet, und die Endkonzentrationen lagen im Bereich von 0,19 bis 100 µM. Kurz gesagt, wurden zweifache Reihenverdünnungen der Lipopeptide in einer Platte mit 96 Vertiefungen in PBS mit einem Endvolumen von 100 µl pro Vertiefung durchgeführt, wonach 100 µl LB-Brühe-Medium mit etwa 5 × 105 KBE/ml hinzugefügt wurden In jede Vertiefung wurden Bakterien gegeben. Anschließend wurde die Platte 20 Stunden lang bei 37 °C auf einem Schüttler (400 U/min) inkubiert. Die Wirkung von Lipopeptid-Antibiotika-Kombinationen wurde mithilfe von Schachbrettassays untersucht. Die Tests wurden gemäß den oben durchgeführten MHK- und MBC-Tests durchgeführt, jedoch mit horizontalen und longitudinalen zweifachen Reihenverdünnungen der getesteten Verbindungen. Die Endkonzentrationen der Antibiotika Vancomycin, Tetracyclin, Ciprofloxacin und Rifampicin lagen zwischen 0,031 und 8 µg/ml (S. aureus), während sie bei E. coli, Gentamicin, Cefotaxim und Ciprofloxacin zwischen 0,0078 und 4 µg/ml und bei Rifampicin lagen zwischen 0,78 und 100 µg/ml. Alle MHK-Werte wurden visuell und spektroskopisch (620 nm) als erste Konzentration bestimmt, die das Bakterienwachstum vollständig hemmte. Alle MBC-Werte wurden durch Kultivieren von 10 µl Tropfen aller Konzentrationen, die zu einer vollständigen Hemmung des Bakterienwachstums auf LB-Agarplatten führten, bestimmt. Die niedrigste Konzentration, bei der kein Wachstum beobachtet wurde, stellte den MBC dar. Die fraktionelle Hemmkonzentration (FIC) und die fraktionierte bakterizide Konzentration (FBC) wurden durch die Gleichung (MIC oder MBC des Peptids in Kombination/MIC oder MBC des Peptids allein) + (MIC oder MBC des Antibiotikums in Kombination/MIC oder MBC des Antibiotikums) berechnet allein). Synergie wurde definiert als FIC/FBC ≤ 0,5, additiv, wenn 0,5 < FIC/FBC ≤ 1, indifferent, wenn 1 < FIC/FBC < 2 und antagonistisch, wenn FIC/FBC ≥ 2. Alle Experimente wurden mindestens dreimal wiederholt.

Um das Risiko einer Resistenzentwicklung gegenüber dem Lipopeptid zu bewerten, wurde ein serieller Passagentest durchgeführt. Kurz gesagt, S. aureus und E. coli wurden 30 Passagen lang in Gegenwart von L-6-C5-Konzentrationen unterhalb der MHK (1 µM) kultiviert. MHK und MBC wurden für die Passagen 0, 10, 20 und 30 unter Verwendung der Bouillon-Mikroverdünnungsmethode bestimmt und mit den nicht exponierten Bakterien (Passage 0) verglichen.

Die hämolytische Aktivität der Lipopeptide wurde untersucht, indem Blut von gesunden Freiwilligen in heparinisierten Vacutainern gesammelt wurde. Kurz gesagt, das Blut wurde 5 Minuten lang bei 600 × g zentrifugiert und das Erythrozytenpellet wurde dreimal in PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann in PBS suspendiert und in Platten mit 96 Vertiefungen (15 % Erythrozytensuspension/Vertiefung) gegeben, die die Lipopeptide in zweifacher Reihenverdünnung enthielten. Die Platten wurden 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert, gefolgt von einer 5-minütigen Zentrifugation bei 900 × g und einer Absorptionsmessung der Überstände bei 540 nm. Die hämolytische Aktivität (%) wurde berechnet, indem die Negativkontrolle von allen Werten abgezogen und mit der Positivkontrolle (0,5 % Triton X-100) normalisiert wurde, die auf 100 % gesetzt wurde. Alle Experimente wurden jeweils in zweifacher Ausfertigung dreimal wiederholt.

Der Fluoreszenzfarbstoff Sytox® Green wurde verwendet, um die durch die Lipopeptide verursachte Membranpermeabilisierung zu untersuchen. Dieses Fluorophor kann beschädigte Membranen nur durchdringen und bei der Bindung an Nukleinsäuren fluoreszieren. Die Bakterien wurden gewaschen und in PBS resuspendiert und 5 Minuten lang mit oder ohne Peptide in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen inkubiert. Die Bilder wurden mit der Olympus BX41 aufgenommen.

Die ethische Genehmigung für die Entnahme von heparinisiertem Blut von gesunden Freiwilligen wurde von der regionalen Ethikkommission des Landkreises Örebro-Uppsala genehmigt (Dnr 2015/543). Von allen Freiwilligen wurde eine Einverständniserklärung eingeholt. Die Blutentnahme und die damit verbundenen Methoden wurden gemäß den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.

Während AMPs eine heterogene Restlänge aufweisen, bestehen die meisten natürlich vorkommenden kationischen AMPs typischerweise aus 12–100 Aminosäuren25. Es hat sich jedoch gezeigt, dass mehrere synthetische kationische AMPs bei Restzahlen < 10 effizient sind, was dazu beitragen kann, einen Teil der inhärenten Einschränkungen mehrerer AMPs zu lösen, nämlich ihre sperrige Größe und die hohen Synthesekosten26. Lata und Kollegen20, die Entwickler des AntiBP-Servers, der für einen Teil unserer Vorhersagen verwendet wurde, kamen zu dem Schluss, dass Peptide, die aus 15 Aminosäuren bestehen, für die Verwendung ihres Servers optimal seien. Eine Übersicht über den unten beschriebenen Prozess ist in Abb. 1 dargestellt. Unter Berücksichtigung der oben genannten Punkte wurde die Sequenz von PLNC8 β mit dem Ziel, möglichst kurze und effektive AMPs zu entwerfen, auf 16 Aminosäuren gekürzt (Rest Nr. 1). –16), wonach eine Aminosäure aus der N-terminalen Region entfernt und eine Aminosäure zur C-terminalen Region hinzugefügt wurde. Dies wurde in der gesamten Sequenz von PLNC8 β, die aus 34 Aminosäuren besteht, durchgeführt und eine kleine Bibliothek von 19 verschiedenen Peptidsequenzen generiert, die jeweils aus 16 Aminosäuren bestehen. Diese Sequenzen wurden dann auf den AntiBP20- und ADAM-Servern21 analysiert, um die antimikrobielle Aktivität basierend auf der Aminosäurezusammensetzung/-muster bzw. der Sequenz-zu-Struktur-Beziehung vorherzusagen. Bei zehn der Sequenzen handelte es sich vermutlich um antimikrobielle Peptide. Darüber hinaus wurde das Peptid mit der insgesamt höchsten Bewertung der verkürzten Sequenzen für die Restsubstitution ausgewählt und in ähnlicher Weise auf die vorhergesagte antimikrobielle Aktivität hin bewertet, wodurch eine Bibliothek von 24 Sequenzen mit vorhergesagter antimikrobieller Aktivität erstellt wurde (Tabelle 1).

Überblick über die Designstrategie der Lipopeptide. Schematische Darstellung des Verkürzungs- und Mutationsprozesses des Peptids PLNC8 β (Sequenz oben geschrieben). Ein hellgrünes Kästchen zeigt Aminosäuren in der L-Form an, ein dunkelgrünes Kästchen zeigt Aminosäuren in der D-Form und ein graues Kästchen zeigt Kohlenstoffatome an. Das gelb hervorgehobene Kästchen weist auf eine hohe vorhergesagte antimikrobielle Aktivität hin.

Die 15 Peptidsequenzen mit der höchsten Bewertung aus dieser Bibliothek wurden mit einem acetylierten N-Terminus und einem amidierten C-Terminus synthetisiert. Die antimikrobiellen Aktivitäten dieser 15 Peptide wurden gegen S. aureus und E. coli untersucht. Während für alle 15 Sequenzen eine antimikrobielle Aktivität vorhergesagt wurde, zeigte nur Peptid 6 in vitro eine tatsächliche hemmende und bakterizide Aktivität gegen beide Bakterien mit einer MHK und MBC von 100 µM für S. aureus und 50 µM für E. coli (Tabelle 2). Die antimikrobielle Aktivität von Peptid 6 gegen E. coli war vergleichbar mit der Aktivität von LL-37, während PLNC8 β in voller Länge keine Aktivität zeigte. Peptid 18 zeigte bei einer Endkonzentration von 100 µM bakteriostatische Aktivität gegen E. coli, ohne irgendeine bakterizide Aktivität zu zeigen.

Da Peptid 6 in vitro antibakterielle Aktivität sowohl für S. aureus als auch für E. coli zeigte, wurden zusätzliche Modifikationen zur Verbesserung seiner Stabilität gegen proteolytischen Abbau und seiner antimikrobiellen Aktivität, einschließlich FA-Konjugation und PEGylierung der N-terminalen Region, durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass die Konjugation einer hydrophoben Einheit, wie z. B. einer FA, an antimikrobielle Peptide deren Aktivität und Selektivität moduliert. Abhängig vom Peptid und den Eigenschaften der konjugierten Einheit kann diese Art der Modifikation sowohl vorteilhaft als auch schädlich sein, z. B. die antimikrobielle Aktivität und Selektivität für Bakterienmembranen gegenüber eukaryotischen Zellen beeinflussen27. PEGylierung wird in mehreren pharmakologischen Produkten verwendet, hauptsächlich um die Halbwertszeit von Arzneimitteln durch Verhinderung des proteolytischen Abbaus zu verbessern, kann aber auch andere positive Auswirkungen haben, wie z. B. die Verringerung der Erkennung durch das Immunsystem28. Die PEGylierung steigerte die antimikrobielle Aktivität von Peptid 6 nicht, im Gegensatz dazu erhöhte die Konjugation einer FA-Kette die antimikrobielle Aktivität deutlich (Tabelle 3). Im Vergleich zu 6 nahmen die MHK- und MBC-Werte proportional zur Kettenlänge des FA ab, wobei ein Optimum bei fünf bis sieben Kohlenstoffatomen (L-6-C5, L-6-C6 und L-6-C7) beobachtet wurde. Eine Erhöhung der FA-Kettenlänge auf acht Kohlenstoffatome (L-6-C8) erhöhte die antimikrobielle Aktivität gegen S. aureus nicht weiter, während eine Abnahme der Aktivität gegen E. coli mit einem Anstieg der MHK- und MBC-Werte von 6,2 µM auf 12,5 beobachtet wurde µM bzw. Eine FA-Kette mit ≥ 10 Kohlenstoffatomen reduzierte die bakterielle Hemmung drastisch und hob die bakterizide Wirkung vollständig auf. Darüber hinaus zeigten die D-Enantiomere von 6-C5, 6-C6 und 6-C7 eine erhöhte antimikrobielle Aktivität sowohl gegen S. aureus als auch gegen E. coli. Um die Faltung der Lipopeptide weiter zu fördern, umfasste eine zusätzliche Modifikation von L/D-6-C5, L/D-6-C6 und L/D-6-C7 den Ersatz aller drei Isoleucin (Ile)-Reste durch Leucin (Leu). . Leu hat eine höhere Neigung zur α-Helix als Ile, was unserer Hypothese nach die Membranaktivität der Lipopeptide weiter erhöhen könnte. Interessanterweise reduzierte die Substitution der drei Ile-Reste durch Leu gegen S. aureus die MHK und MBC gegen S. aureus im Vergleich zu den Ile-haltigen Varianten um etwa 50 %. Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung eines SYTOX-Green-Assays zeigte, dass die membranlytische Wirkung aller Lipopeptide schnell war und dosisabhängig bereits nach 5 Minuten eine erhebliche Bakterienlyse erfolgte (Abb. 2). Bei Lipopeptiden, die mit FA-Ketten mit fünf bis sieben Kohlenstoffatomen modifiziert waren, wurde eine ausgeprägtere Lyse beobachtet als bei Lipopeptiden mit zwei oder acht Kohlenstoffatomen.

Permeabilisierung bakterieller Membranen. Die Aufnahme von Sytox Green durch (A) S. aureus und (B) E. coli wurde nach 5-minütiger Exposition gegenüber unterschiedlichen Konzentrationen acetylierter Peptide in PBS bestimmt, Maßstabsbalken ist 200 µm. Die Konjugation des Peptids mit einer FA-Kette aus fünf bis acht Kohlenstoffatomen ist wirksam bei der Permeabilisierung sowohl grampositiver als auch gramnegativer Bakterienmembranen. Das D-Enantiomer und die Leucin-Variante von 6-C5 waren bei der Permeabilisierung von S. aureus und E. coli genauso wirksam wie die L-Form.

Um die Aktivität des Lipopeptids weiter zu bewerten, wurden die MHK und MBC der führenden Verbindungen (L/D-6-C5 und L/D-6-C5-Leu) für weitere Stämme von S. aureus und E. bestimmt. coli. 18 klinische Isolatstämme von S. aureus und 18 klinische Isolatstämme von E. coli wurden von der Abteilung für Labormedizin des Universitätskrankenhauses Örebro erhalten. Von den S. aureus-Stämmen wurden neun Stämme als MSSA und neun als MRSA identifiziert. Für E. coli wurden acht Stämme als ESBL-Stämme identifiziert und die restlichen 10 E. coli-Stämme zeigten keine oder nur geringe Antibiotikaresistenz (Ergänzungstabelle S1). Zusätzlich zu S. aureus und E. coli wurden Empfindlichkeitstests für L/D-6-C5 und L/D-6-C5-Leu für klinische Isolate der übrigen ESKAPE-Erreger (E. faecium, K. pneumoniae) durchgeführt , A. baumannii, P. aeruginosa und E. cloacae). Alle getesteten Stämme, mit Ausnahme von E. cloacae, waren anfällig für alle C5-Varianten. E. cloacae war zwar anfällig für die D-Enantiomere von 6-C5 und 6-C5-Leu, wurde jedoch durch die L-Enantiomere nicht vollständig gehemmt, obwohl eine gewisse Hemmung beobachtet werden konnte. Die MHK und MBC dieser Bakterien sind in Tabelle 4 aufgeführt.

Die Zytotoxizität und hämolytische Aktivität synthetischer AMPs war problematisch und stellt einen wichtigen Aspekt dar, der sorgfältig bewertet werden muss. Es wurde festgestellt, dass die hämolytische Aktivität mit der Länge der FA-Kette zusammenhängt (Abb. 3A). Lipopeptide mit einer FA-Kettenlänge von ≤ 6 Kohlenstoffatomen verursachten bei 100 µM nach einstündiger Inkubation mit Erythrozyten in PBS bei 37 °C eine Hämolyse von weniger als 5 %. Lipopeptide mit FA-Ketten mit 7–10 Kohlenstoffatomen verursachten etwa 10 % Hämolyse. Durch Erhöhen der Länge der FA-Kette auf 15 Kohlenstoffatome erhöhte sich die Hämolyse auf 40 %. Die L-Enantiomere von 6-C5, 6-C6 und 6-C7 zeigten eine höhere hämolytische Aktivität als das entsprechende D-Enantiomer und erreichten ~ 10 %. Bei den Leu-haltigen Varianten wurde ein zusätzlicher Anstieg der hämolytischen Aktivität beobachtet (Abb. 3B). Die D-Enantiomere von 6-C5, 6-C6 und 6-C7 zeigten eine ähnliche hämolytische Aktivität wie die L-Formen (Abb. 3C). Die hämolytische Aktivität bei 100 µM im Verhältnis zur FA-Kettenlänge ist in Abb. 3D dargestellt.

Hämolytische Aktivität von Volllängen- und modifizierten Peptiden von PLNC8 β. Die hämolytische Aktivität wurde an menschlichen Erythrozyten (15 % suspendiert in PBS) nach (A) Exposition gegenüber den Peptiden mit unterschiedlich langen FA-Ketten unter Verwendung der angegebenen Konzentrationen für 1 Stunde bestimmt. Die hämolytische Aktivität war mit der Länge der FA-Kette verbunden, wobei die Konjugation einer langen FA-Kette (≥ 7 Kohlenstoffatome) die Peptide stärker hämolytisch machte. Hämolytische Aktivität der L-Enantiomere (B) und D-Enantiomere (C) von 6-C(5–7) sowohl der Isoleucin- als auch der Leucin-Variante. Der Ersatz aller drei Isoleucinreste durch Leucin führte dazu, dass das Lipopeptid stärker hämolytisch wirkte. (D) Hämolytische Aktivität bei 100 µM im Hinblick auf die FA-Kettenlänge.

Die Membranaktivität der Lipopeptide wurde außerdem anhand von Liposomenmodellen mit entweder prokaryotischen oder eukaryotischen nachahmenden Lipidzusammensetzungen bestätigt. Die Fähigkeit der Lipopeptide, die Integrität der Lipidmembran zu stören, wurde untersucht, indem die Freisetzung des in den Liposomen eingekapselten Fluoreszenzfarbstoffs Carboxyfluorescein (CF) bei selbstlöschenden Konzentrationen überwacht wurde (ergänzende Abbildung S3). Es wurde beobachtet, dass die Permeabilisierung von bakterienähnlichen Liposomen bei einer Lipopeptidkonzentration <1 µM für alle Sequenzen mit einer FA-Kettenlänge von acht oder weniger Kohlenstoffatomen stattfand (ergänzende Abbildung S3A). Eine Vergrößerung der FA-Kette führte zu einer Abnahme der Membranaktivität (ergänzende Abbildung S3B). Als Kontrollen wurden PLNC8 β in voller Länge und das vom Menschen stammende antimikrobielle Peptid LL-37 verwendet (ergänzende Abbildung S3F). Die CF-Freisetzung war bei den Lipopeptiden langsamer als bei PLNC8 β voller Länge. Letzteres zeigte eine Permeabilisierung der Liposomenmembranen bereits bei Konzentrationen von nur 100 pM, was nach 60-minütiger Inkubation zu einer CF-Freisetzung von ~ 20 % führte (ergänzende Abbildung S4). Die Membranaktivität von LL-37 war allen Lipopeptiden mit einer FA-Kette mit weniger als acht Kohlenstoffatomen unterlegen (Tabelle 5).

Die Membranaktivität wurde weiter im Hinblick auf Liposomen untersucht, die Säugetier-Lipidmembranen imitieren. Es wurde gemessen, dass der Permeabilisierungseffekt im Vergleich zu bakterienähnlichen Liposomen etwa 10- bis 100-fach höher ist, was die Eignung dieser Lipopeptide für den Einsatz beim Bakterien-Targeting belegt (Tabelle 5). Die Membranaktivität nahm mit der FA-Kettenlänge auf bis zu 8 Kohlenstoffatome zu, danach war kein weiterer Anstieg zu beobachten (ergänzende Abbildung S3G, H).

Unabhängig von der Lipidzusammensetzung hatten sowohl die L- als auch die D-Enantiomere der Lipopeptide eine ähnliche Membranaktivität und CF-Freisetzungskinetik (Ergänzende Abbildungen S3C – E, I – K, S4, S5). Überraschenderweise führte der Ersatz von Leucin durch Isoleucin zu einem leichten Anstieg der Membranaktivität sowohl bei bakteriellen als auch bei Säugetier-Liposomen, die die Lipidmembran nachahmen, wobei der Effekt bei letzteren am ausgeprägtesten war (Tabelle 5).

Da die Lipopeptide amphipathisch sind, neigen sie möglicherweise dazu, sich selbst zu größeren supramolekularen Strukturen zusammenzufügen, was die Membranaktivität beeinflussen könnte. Wir verwendeten dynamische Lichtstreuung (DLS), um die Lipopeptidaggregation und die Abhängigkeit der FA-Kettenlänge von ihrer Löslichkeit zu untersuchen, wobei wir uns auf die Peptide L-6, L-6-C2, L-6-C5 und L-6-C7 konzentrierten. Der amphiphile Charakter von Lipopeptiden bestimmt ihre Neigung zur Selbstorganisation in wässrigen Lösungen. Wir können daher die Hypothese aufstellen, dass die Lipopeptide mizellartige Strukturen bilden, die im dynamischen Gleichgewicht mit gelösten Lipopeptidmonomeren stehen. Oberhalb der kritischen Aggregationskonzentration (CAC) wird die Bildung größerer Aggregate auf Kosten der gelösten Lipopeptide begünstigt, was zu einer Erhöhung der Streuintensität im DLS führt. Der CAC der Lipopeptide L-6, L-6-C2, L-6-C5 und L-6-C7 wurde auf 10, 8, 5,6 bzw. 0,8 μM geschätzt (Abb. 4B – F), was die Korrelation hervorhebt zwischen der FA-Kettenlänge und der Aggregationsneigung.

Charakterisierung der Sekundärstruktur und Bestimmung der kritischen Aggregationskonzentration (CAC). (A) CD-Spektren von 30 µM L-6-C5- und L-6-C5-Leu-Peptiden ohne (gepunktete Linie) und mit (durchgezogene Linie) 1,2 mM POPC:POPG (75:25) Liposomenmodellen in PBS-Puffer (10). mM, pH 7,4). Einschub: Analyse der Aminosäureneigung von (i) L-6-C5- und (ii) L-6-C5-Leu-Peptidsequenzen (mit Ausschluss des Fettsäureschwanzes). (BE) DLS-Analyse: Streuintensität der Lipopeptide (B) L-6, (C) L-6-C2, (D) L-6-C5 und (E) L-6-C7 in 10 mM PBS (pH 7,4). ). (F) Zusammenhang zwischen kritischer Aggregationskonzentration (CAC) und Fettsäurekettenlänge der Lipopeptide L-6, L-6-C2, L-6-C5 und L-6-C7.

AMPs sind typischerweise zufällige Knäuel in Lösung, falten sich jedoch bei Interaktion mit Bakterienmembranen. Die Sekundärstruktur der Lipopeptide L-6-C5 und L-6-C5-Leu wurde mithilfe der Zirkulardichroismus-Spektroskopie (CD) (Abb. 4A) in Abwesenheit und Anwesenheit von bakterienähnlichen Liposomenmodellen aus POPC:POPG bewertet ( 75:25). Bei beiden Lipopeptiden handelte es sich in Lösung ohne Lipidmembranen überwiegend um Zufallsknäuel. Allerdings beobachteten wir bei der Interaktion mit Liposomen eine deutliche Veränderung der Sekundärstruktur des Lipopeptids, was teilweise auf das Vorhandensein von α-helikalen Sekundärstrukturelementen hindeutet. Das Lipopeptid L-6-C5 stellt eine homogene Mischung von Aminosäuren mit sowohl a-Helix- als auch β-Strang-Neigung sowie zwei strukturbrechenden Resten29, Gly und Ser, in Position 2 bzw. 8 dar. Eine wohldefinierte Sekundärstruktur ist daher weder in Lösung noch bei Wechselwirkung mit Lipidmembranen zu erwarten. Der Austausch von Ile gegen Leu in den Positionen 3, 5 und 16, wodurch das Lipopeptid L-6-C5-Leu entsteht, erhöht die Anzahl der Aminosäuren mit hoher α-Helix-Neigung von 7 auf 10 (Abb. 4A, ii)30. Obwohl Leu (0,21 kcal/mol) eine sehr ähnliche Hydrophobie aufweist, ist es ein deutlich besserer Helixbildner als Ile (0,41 kcal/mol). Obwohl diese Modifikation die MHK- und MBC-Werte verbesserte, wurden jedoch keine signifikanten Veränderungen in der Sekundärstruktur beobachtet, was wahrscheinlich auf die Clusterbildung der Leucinreste in der Nähe des Peptid-N-Terminus (Leu-Lys-Leu-Leu in Position 3–6) zurückzuführen ist ), das von Gly in Position 2 und Ser in Position 8 flankiert wird, was die helikale Struktur destabilisiert.

Ein großes Problem bei der Entwicklung neuer antibakterieller Verbindungen ist das Risiko der Resistenzentwicklung. Sowohl S. aureus als auch E. coli, die 30 Passagen lang in Gegenwart von L-6-C5-Konzentrationen unterhalb der MHK kultiviert wurden, behielten die gleichen MHK- und MBC-Werte wie die nicht exponierten Bakterien (Passage 0), was darauf hinweist, dass sich keine Resistenz entwickelt ( Ergänzungstabelle S2).

Die L- und D-Enantiomere des Lipopeptids 6-C5 und die L- und D-Enantiomere der Varianten von 6-C5-Leu mit Leucin durch Isoleucin ersetzt wurden mit verschiedenen Antibiotika kombiniert und die antimikrobielle Aktivität gegen E. coli und bestimmt S. aureus. Die Lipopeptide waren in der Lage, die zur Hemmung und Abtötung der Bakterien erforderlichen Antibiotikakonzentrationen in den meisten getesteten Kombinationen additiv oder synergistisch zu senken, obwohl einige Kombinationen einen indifferenten Zusammenhang aufweisen. Wichtig ist, dass keine der Kombinationen Anzeichen einer antagonistischen Wirkung aufwies (Tabelle 6).

Wir haben kürzlich gezeigt, dass die antimikrobielle Aktivität des Bakteriocins PLNC8 αβ gegen Staphylococcus spp. optimal ist, wenn sowohl die α- als auch die β-Peptide zusammen in einem Molverhältnis von 1:114 verwendet werden. PLNC8 αβ ist ein effizientes und wertvolles Bakteriozin gegen grampositive Bakterien. Es wäre jedoch von Vorteil, kurze und optimierte Peptide von PLNC8 αβ mit breitem Aktivitätsspektrum zu entwickeln, um auch schwierige Infektionen durch gramnegative Bakterien zu bekämpfen. PLNC8 β, jedoch nicht PLNC8 α, zeigte lytische Aktivität auf Liposomen und gegen Bakterien, diese reichte jedoch nicht aus, um das Bakterienwachstum zu hemmen. Die Entwicklung kurzer und optimierter antimikrobieller Peptide basierte daher auf der Aminosäuresequenz von PLNC8 β.

Wir konnten mehrere neuartige Verbindungen identifizieren und entwickeln, die in vitro bereits bei sehr geringen Dosen eine hohe antimikrobielle Aktivität aufweisen. Chu-Kung und Kollegen27 zeigten eine erhöhte antimikrobielle Aktivität von Peptiden nach der Konjugation von Laurinsäure (FA-Kette mit einem 12-Kohlenstoffatom-Rückgrat). Unsere Ergebnisse, nach der Konjugation einer kurzen FA-Kette (fünf bis sieben Kohlenstoffatome) eine deutlich verbesserte antimikrobielle Aktivität zu erzielen, sind daher überraschend. Laverty et al., 201031 analysierten eine Reihe von Lipopeptiden mit unterschiedlich langen FAs und zeigten, dass die antimikrobielle Aktivität durch eine Erhöhung der Länge der FA-Kette verstärkt wurde. Die effektivste Variante umfasste eine FA-Kette mit 12 Kohlenstoffatomen, was mit den Ergebnissen von Chu-Kung und Kollegen übereinstimmt27. Allerdings erwies sich dieses Lipopeptid bei Konzentrationen ≥ 50 µg/ml als stark hämolytisch und zytotoxisch, was zu einer vollständigen Hämolyse führte. Unsere Ergebnisse zeigten auch eine erhöhte hämolytische Aktivität mit zunehmender FA-Länge, aber da die antibakterielle Aktivität in unseren Lipopeptiden mit FA-Ketten aus 8 Kohlenstoffatomen oder mehr verringert war, wurden die Lipopeptide, die mit der kürzeren FA-Kette aus 5–7 Kohlenstoffatomen konjugiert waren, als die besten angesehen Kandidaten für die weitere Prüfung. Darüber hinaus zeigten die D-Enantiomere von 6-C5, 6-C6 und 6-C7 eine erhöhte antimikrobielle Aktivität sowohl gegen S. aureus als auch gegen E. coli, was wahrscheinlich auf die Resistenz gegen proteolytischen Abbau zurückzuführen ist. Der gleiche Trend konnte bei den ESKAPE-Erregern beobachtet werden, bei denen die D-Enantiomere eine bessere Aktivität zeigten als die L-Enantiomere, insbesondere bei K. pneumoniae, P. aeruginosa und E. cloacae. Der auffälligste Unterschied wurde bei E. cloacae beobachtet, wo die höchste Konzentration der getesteten L-Enantiomere (100 µM) nicht ausreichte, um die Bakterien vollständig zu hemmen und abzutöten, was auf eine erhöhte proteolytische Aktivität bei einigen dieser Stämme hindeutet, was im Einklang steht mit gemeldeter Pathogenität und Resistenz unter klinischen Isolaten der ESKAPE-Erreger.32.

Darüber hinaus steigerte der Ersatz von Isoleucin durch Leucin die antimikrobielle Aktivität des Lipopeptids weiter. Wie in den Ergebnissen erwähnt, neigt Leucin stärker zur α-Helix-Bildung als Isoleucin, was möglicherweise eine Erklärung für die erhöhte Aktivität ist, obwohl keine signifikante Änderung der Sekundärstruktur beobachtet wurde. Darüber hinaus wurde bereits früher berichtet, dass die einmalige Substitution von Leucin durch Isoleucin oder umgekehrt die Funktion von Proteinen und Antikörpern verändert33,34, was die in unseren Ergebnissen beobachtete erhöhte antimikrobielle Aktivität erklären könnte, der genaue Mechanismus muss jedoch noch ermittelt werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Peptid bestimmte Zielmoleküle, z. B. Proteine ​​und Glykoproteine ​​auf der Bakterienoberfläche, nicht erkennt und nicht daran bindet, was darauf hindeutet, dass die anfängliche Bindung durch elektrostatische Wechselwirkungen mit anionischen Bakterienstrukturen wie Membranlipiden gesteuert wird, was tatsächlich eine davon ist die gemeinsamen Wirkmechanismen von AMPs35. Obwohl die genauen Mechanismen noch geklärt werden müssen, einschließlich anfänglicher Wechselwirkungen mit der Bakterienzellwand (grampositiv) oder der äußeren Membran (gramnegativ), deutet die schnelle Permeabilisierung darauf hin, dass das endgültige und Hauptziel der Lipopeptide tatsächlich Bakterienmembranen sind.

Mithilfe dynamischer Lichtstreuungsstudien konnte die Rolle der Lipopeptidaggregation im Prozess der Permeabilisierung der Bakterienmembran hervorgehoben werden. Die Aggregation der Lipopeptide L-6, L-6-C2, L-6-C5 und L-6-C7 wurde in Puffer bewertet und zeigte eine Abnahme der kritischen Aggregationskonzentration (CAC) mit einer Zunahme der Kohlenstoffschwanzlänge CACs entsprechend 10 µM, 8 µM, 5,6 µM bzw. 0,8 µM (Abb. 4 BF). Beim Vergleich der CAC-Werte mit MBC stellten wir fest, dass letztere höher waren als CAC gegen beide grampositiven S. aureus (> 100 μM, 100 μM, 6,2 μM und 3,1 μM relativ zu den Lipopeptiden L-6, L-6-C2). , L-6-C5 bzw. L-6-C7) und gramnegative E. coli (> 100 μM, 50 μM, 6,2 μM und 6,2 μM, relativ zu den Lipopeptiden L-6, L-6-C2, L-6-C5 bzw. L-6-C7). Diese Ergebnisse weisen stark darauf hin, dass die Bildung von Lipopeptidaggregaten zu ihrer antimikrobiellen Aktivität beiträgt.

Obwohl der genaue Wirkmechanismus noch unbekannt ist, können einige Schlussfolgerungen gezogen werden. Es ist bekannt, dass Lipopeptide aufgrund ihrer amphiphilen Natur spontan interagieren und sich organisieren und mizellenartige Strukturen bilden36,37. Die anfängliche treibende Kraft für die Assoziation mit der Bakterienmembran ist, wie oben erwähnt, die elektrostatische Wechselwirkung. Die Anziehung zwischen den kationischen Resten (Arg und Lys, jeweils in Position 13 und 4, 11, 14) und den negativ geladenen Phosphatgruppen der Bakterienmembran stabilisiert die Wechselwirkungen durch Wasserstoffbrückenbindungen37,38. Ein zweites Ereignis, das die Lipopeptid-Assoziation mit der Bakterienmembran antreibt, ist der hydrophobe Effekt und Van-der-Waals-Wechselwirkungen zwischen den Lipopeptid-Acylketten und dem hydrophoben Kern der Bakterienmembran, die zu einer Lipid-Membran-Aufteilung führen. Aufgrund einer schlechten Mizellverpackung36 oder einer Ordnungsstörung derselben als Folge der anfänglichen Mizell-Membran-Bindung37 stehen freiliegende Lipidschwänze für die Interaktion zur Verfügung, was zur Aggregatdissoziation und Lipopeptidinsertion in die Lipiddoppelschicht führt. Obwohl noch nicht bekannt ist, ob die Aggregate oder die einzelnen Lipopeptide am meisten zur Zelllyse beitragen, scheint es sicher, dass die Aggregatansammlung an der Bakterienmembranoberfläche die lokale Konzentration der Lipopeptide drastisch erhöht, was zu einer effizienten Membranzerstörung führt38. Wie die CD-Spektroskopie zeigte, lösten diese Wechselwirkungen keine Veränderungen in der Sekundärstruktur des Lipopeptids aus, was sonst bei AMPs sehr häufig vorkommt.

Zusätzlich zu ihrer inhärenten Fähigkeit, Bakterien abzutöten oder das Bakterienwachstum zu hemmen, sind antimikrobielle Peptide, die auf Bakterienmembranen abzielen, auch attraktive Kandidaten für den Einsatz in Kombination mit konventionelleren Antibiotika, um deren Wirksamkeit zu erhöhen und die Entwicklung und Ausbreitung antimikrobieller Resistenzen zu unterdrücken. Es wurde gezeigt, dass Nisin synergistisch mit Zitronensäure39, Penicillin und Chloramphenicol40 gegen mehrere Staphylococcus-Arten wirkt. Wir haben zuvor gezeigt, dass Plantaricin A, E, F, J, K41 und NC8 αβ14 die Wirkung mehrerer Antibiotika, darunter Vancomycin, Teicoplanin, Rifampicin, Gentamicin und Tetracyclin, gegen Staphylococcus-Arten erheblich verstärken. Unsere Ergebnisse legen außerdem nahe, dass die hier vorgestellten neuen Lipopeptide auch in Kombination mit Antibiotika eingesetzt werden können. Eine Kombinationstherapie wurde eingesetzt, um die erforderliche Antibiotikakonzentration zu reduzieren und dadurch mögliche Nebenwirkungen, Umweltverschmutzung und Resistenzentwicklung zu reduzieren.

Die Leichtigkeit, mit der Bakterien Resistenzen gegen Antibiotika entwickeln können, ist einer der Gründe dafür, dass in den letzten Jahrzehnten nur wenige neue Antibiotikaklassen für den klinischen Einsatz verfügbar gemacht wurden. Nur noch sehr wenige große Pharmaunternehmen sind im Bereich der Antibiotikaforschung aktiv, ein Bereich, der heute hauptsächlich in kleineren akademischen Labors betrieben wird. Der Grund ist hauptsächlich ein finanzielles Problem; Aufgrund der mit der Entwicklung von Resistenzen gegen neue Antibiotikaverbindungen verbundenen Risiken ist der Bereich Antibiotika nicht so profitabel wie mehrere andere Bereiche der Arzneimittelentwicklung42,43. Obwohl das Risiko der Entwicklung einer bakteriellen Resistenz gegen AMPs lange Zeit als gering eingeschätzt wurde, was zu dem gestiegenen Interesse an der Forschung zu AMPs beigetragen hat, häufen sich Berichte über AMP-Resistenzen. Zu den bakteriellen Resistenzmechanismen gegen AMPs gehören die Verwendung proteolytischer Enzyme und Membranveränderungen, die zu einer Änderung der Nettoladung führen und somit die Fähigkeit des Peptids zur Interaktion mit der Membran einschränken44. Man muss daher auch bei der Forschung zu AMPs die Möglichkeit einer Resistenzentwicklung berücksichtigen. Unsere Ergebnisse zeigten bei keinem der getesteten Bakterien Anzeichen einer Resistenzentwicklung, wenn sie 30 Passagen lang Konzentrationen des Lipopeptids unterhalb der MHK ausgesetzt wurden, was wiederum darauf hindeutet, dass die evolutionär konservierten Lipidmembranen der Bakterien das Ziel des Peptids darstellen. Wie oben erwähnt, kann die Verwendung von D-Enantiomeren auch eine Strategie zur Bekämpfung des Abbaus durch Proteasen sein, obwohl unklar ist, wie sich dies insbesondere bei systemischer Verabreichung auf die Toxizität und Akkumulation auswirken könnte. Dennoch ist es bei ausreichender Zeit wahrscheinlich, dass sich eine gewisse Resistenz entwickelt, und wie bei allen antibakteriellen Substanzen muss darauf geachtet werden, eine unnötige Exposition zu vermeiden.

Während in den letzten Jahrzehnten zahlreiche verschiedene antimikrobielle Peptide mit hervorragender Wirkung in vitro identifiziert wurden, haben es nur wenige aufgrund von Einschränkungen wie proteolytischer Anfälligkeit, Zytotoxizität, schlechter Bioverfügbarkeit und kontextueller Sensitivität in die klinische Praxis geschafft und wurden tatsächlich klinisch hergestellt Die verfügbaren Medikamente sind meist für die topische Anwendung formuliert45. Daher werden biotechnologisch hergestellte Modifikationen von AMPs, wie sie in diesem Artikel untersucht werden, immer relevanter, um diese Einschränkungen zu überwinden und AMPs besser für die pharmakologische Verwendung geeignet zu machen46. Während weitere Forschung erforderlich ist, um den potenziellen therapeutischen Einsatz dieser neuartigen Lipopeptide zu bestimmen, wobei In-vivo-Studien zur Toxizität und Aktivität von Lipopeptiden von besonderer Bedeutung sind, ist die Selektivität der Lipopeptide gegenüber Bakterienmembranen im Vergleich zu Säugetiermembranen ein vielversprechender Aspekt.

Zusammenfassend haben wir einen rationalen Designprozess durchgeführt, um eine kleine Bibliothek neuartiger Lipopeptide zu identifizieren, die von Plantaricin NC8 αβ abgeleitet sind. Die Lipopeptide zeigen selbst bei mikromolaren Konzentrationen eine wirksame antibakterielle Aktivität sowohl gegen grampositive als auch gegen gramnegative Bakterien. Unter Berücksichtigung der oben dargestellten hämolytischen Aktivität und des EC50 sowie der relativen Ähnlichkeiten der antimikrobiellen Aktivität zwischen den mit FA-Ketten mit 5–7 Kohlenstoffatomen ergänzten Verbindungen schlagen wir vor, dass die Verbindungen mit einem FA-Schwanz mit 5 Kohlenstoffatomen konjugiert sind (6 -C5 und 6-C5-Leu) sind für die weitere Forschung von größtem Interesse. Darüber hinaus bieten die in dieser Studie verwendeten Methoden zur Identifizierung und Gestaltung dieser Lipopeptide zusätzliche Wege für die Entwicklung neuer antimikrobieller Verbindungen. Während PLNC8 αβ ein interessanter pharmazeutischer Kandidat bleibt, insbesondere für die Behandlung von durch Staphylococcus spp. verursachten Infektionen, bieten die hier vorgestellten Lipopeptide mehrere Vorteile. Während PLNC8 αβ eine begrenzte Löslichkeit aufweist und unter physiologischen Bedingungen zur Ausfällung neigt (Daten nicht veröffentlicht), bilden die Lipopeptide kolloidal stabile Aggregate. Darüber hinaus sind die Lipopeptide im Vergleich zu PLNC8 αβ, einem Bakteriocin mit zwei Peptiden, das ein α- und ein β-Peptid mit 29 bzw. 34 Resten umfasst47, weniger komplex. Dennoch ist die antibakterielle Aktivität dieser Lipopeptide deutlich höher als bei PLNC8 αβ und sie sind sowohl gegen grampositive als auch gramnegative Bakterien wirksam, was eine äußerst gewünschte Eigenschaft für jede neue antibakterielle Verbindung ist.

Die im Rahmen der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

Assis, LM, Nedeljkovic, M. & Dessen, A. Neue Strategien zur Bekämpfung und Behandlung von multiresistenten Staphylococcus aureus. Drogenresistent. Aktualisierungen 31, 1–14. https://doi.org/10.1016/j.drup.2017.03.001 (2017).

Artikel Google Scholar

Fridkin, SK et al. Epidemiologische und mikrobiologische Charakterisierung von durch Staphylococcus aureus verursachten Infektionen mit verringerter Empfindlichkeit gegenüber Vancomycin, USA, 1997–2001. Klin. Infizieren. Dis. 36, 429–439. https://doi.org/10.1086/346207 (2003).

Artikel PubMed Google Scholar

Kali, A. Antibiotika und bioaktive Naturprodukte zur Behandlung von Methicillin-resistentem Staphylococcus aureus: Ein kurzer Überblick. Pharmakogn. Offb. 9, 29–34. https://doi.org/10.4103/0973-7847.156329 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lowy, FD Antimikrobielle Resistenz: Das Beispiel von Staphylococcus aureus. J. Clin. Investig. 111, 1265–1273. https://doi.org/10.1172/JCI18535 (2003).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cotter, PD, Ross, RP & Hill, C. Bakteriozine: Eine praktikable Alternative zu Antibiotika?. Nat. Rev. Microbiol. 11, 95–105. https://doi.org/10.1038/nrmicro2937 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Czaplewski, L. et al. Alternativen zu Antibiotika – eine Überprüfung des Pipeline-Portfolios. Lanzette. Infizieren. Dis 16, 239–251. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(15)00466-1 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yang, SC, Lin, CH, Sung, CT & Fang, JY Antibakterielle Aktivitäten von Bakteriozinen: Anwendung in Lebensmitteln und Pharmazeutika. Vorderseite. Mikrobiol. 5, 241. https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00241 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Diep, DB, Straume, D., Kjos, M., Torres, C. & Nes, IF Ein Überblick über die Mosaik-Bakteriocin-PLN-Loci aus Lactobacillus plantarum. Peptide 30, 1562–1574. https://doi.org/10.1016/j.peptides.2009.05.014 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ekblad, B. et al. Struktur-Funktions-Analyse des Zwei-Peptid-Bakteriozins Plantaricin EF. Biochemie 55, 5106–5116. https://doi.org/10.1021/acs.biochem.6b00588 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Oppegard, C., Kjos, M., Veening, JW, Nissen-Meyer, J. & Kristensen, T. Ein mutmaßlicher Aminosäuretransporter bestimmt die Empfindlichkeit gegenüber dem Zwei-Peptid-Bakteriocin Plantaricin JK. MikrobiologieOpen 5, 700–708. https://doi.org/10.1002/mbo3.363 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Moretta, A. et al. Antimikrobielle Peptide: Eine neue Hoffnung im biomedizinischen und pharmazeutischen Bereich. Vorderseite. Zelle. Infizieren. Mikrobiol. 11, 668632. https://doi.org/10.3389/fcimb.2021.668632 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bengtsson, T. et al. Doppelte Wirkung des Bakteriocins PLNC8 alphabeta durch Hemmung der Infektion mit Porphyromonas gingivalis und Förderung der Zellproliferation. Krankheitserreger Dis. https://doi.org/10.1093/femspd/ftx064 (2017).

Artikel Google Scholar

Khalaf, H. et al. Antibakterielle Wirkung von Lactobacillus und Bakteriocin PLNC8 alphabeta auf den parodontalen Erreger Porphyromonas gingivalis. BMC Mikrobiol. 16, 188. https://doi.org/10.1186/s12866-016-0810-8 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bengtsson, T. et al. Plantaricin NC8 alphabeta übt eine starke antimikrobielle Aktivität gegen Staphylococcus spp. aus. und verstärkt die Wirkung von Antibiotika. Wissenschaft. Rep. 10, 3580. https://doi.org/10.1038/s41598-020-60570-w (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mulani, MS, Kamble, EE, Kumkar, SN, Tawre, MS & Pardesi, KR Neue Strategien zur Bekämpfung von ESKAPE-Krankheitserregern im Zeitalter der Antibiotikaresistenz: Ein Überblick. Vorderseite. Mikrobiol. 10, 539. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.00539 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Rozek, A., Powers, JP, Friedrich, CL & Hancock, RE Strukturbasiertes Design eines Indolicidin-Peptidanalogons mit erhöhter Proteasestabilität. Biochemie 42, 14130–14138. https://doi.org/10.1021/bi035643g (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lee, IH, Cho, Y. & Lehrer, RI Auswirkungen von pH-Wert und Salzgehalt auf die antimikrobiellen Eigenschaften von Clavaninen. Infizieren. Immun. 65, 2898–2903. https://doi.org/10.1128/iai.65.7.2898-2903.1997 (1997).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Molchanova, N., Hansen, PR & Franzyk, H. Fortschritte bei der Entwicklung antimikrobieller Peptidmimetika als potenzielle Arzneimittel. Moleküle https://doi.org/10.3390/molecules22091430 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Deslouches, B., Montelaro, RC, Urish, KL & Di, YP Entwickelte kationische antimikrobielle Peptide (eCAPs) zur Bekämpfung multiresistenter Bakterien. Pharmaceutics 12, 501. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics12060501 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lata, S., Sharma, BK & Raghava, GP Analyse und Vorhersage antibakterieller Peptide. BMC Bioinform. 8, 263. https://doi.org/10.1186/1471-2105-8-263 (2007).

Artikel CAS Google Scholar

Lee, HT, Lee, CC, Yang, JR, Lai, JZ & Chang, KY Eine groß angelegte Strukturklassifikation antimikrobieller Peptide. Biomed. Res. Int. 2015, 475062. https://doi.org/10.1155/2015/475062 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shen, Y., Maupetit, J., Derreumaux, P. & Tuffery, P. Verbesserter PEP-FOLD-Ansatz für die Vorhersage der Peptid- und Miniproteinstruktur. J. Chem. Theorieberechnung. 10, 4745–4758. https://doi.org/10.1021/ct500592m (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Thevenet, P. et al. PEP-FOLD: Ein aktualisierter De-novo-Strukturvorhersageserver für lineare und disulfidgebundene zyklische Peptide. Nukleinsäuren Res. 40, W288-293. https://doi.org/10.1093/nar/gks419 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Alland, C. et al. RPBS: Eine Webressource für strukturelle Bioinformatik. Nukleinsäuren Res. 33, W44-49. https://doi.org/10.1093/nar/gki477 (2005).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jenssen, H., Hamill, P. & Hancock, RE Antimikrobielle Peptidwirkstoffe. Klin. Mikrobiol. Rev. 19, 491–511. https://doi.org/10.1128/CMR.00056-05 (2006).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Clark, S., Jowitt, TA, Harris, LK, Knight, CG & Dobson, CB Das Lexikon der antimikrobiellen Peptide: Ein vollständiger Satz von Arginin- und Tryptophan-Sequenzen. Komm. Biol. 4, 605. https://doi.org/10.1038/s42003-021-02137-7 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chu-Kung, AF, Nguyen, R., Bozzelli, KN & Tirrell, M. Kettenlängenabhängigkeit der antimikrobiellen Peptid-Fettsäure-Konjugataktivität. J. Colloid Interface Sci. 345, 160–167. https://doi.org/10.1016/j.jcis.2009.11.057 (2010).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Turecek, PL, Bossard, MJ, Schoetens, F. & Ivens, IA PEGylierung von Biopharmazeutika: Ein Überblick über die Chemie und nichtklinische Sicherheitsinformationen zugelassener Arzneimittel. J. Pharm. Wissenschaft. 105, 460–475. https://doi.org/10.1016/j.xphs.2015.11.015 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Imai, K. & Mitaku, S. Mechanismen von Sekundärstrukturbrechern in löslichen Proteinen. Biophysik 1, 55–65. https://doi.org/10.2142/biophysics.1.55 (2005).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pace, CN & Scholtz, JM Eine Helix-Neigungsskala basierend auf experimentellen Studien von Peptiden und Proteinen. Biophys. J . 75, 422–427. https://doi.org/10.1016/s0006-3495(98)77529-0 (1998).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Laverty, G., McLaughlin, M., Shaw, C., Gorman, SP & Gilmore, BF Antimikrobielle Aktivität kurzer, synthetischer kationischer Lipopeptide. Chem. Biol. Drogen Des. 75, 563–569. https://doi.org/10.1111/j.1747-0285.2010.00973.x (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

De Oliveira, DMP et al. Antibiotikaresistenz bei ESKAPE-Erregern. Klin. Mikrobiol. Rev. https://doi.org/10.1128/CMR.00181-19 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Sitbon, M. et al. Der Ersatz von Isoleucin durch Leucin in einer Sequenz, die unter Glykoproteinen der retroviralen Hüllenoberfläche hoch konserviert ist, schwächt die lytische Wirkung des Friend-Maus-Leukämievirus ab. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 88, 5932–5936. https://doi.org/10.1073/pnas.88.13.5932 (1991).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bagal, D., Kast, E. & Cao, P. Schnelle Unterscheidung von Leucin und Isoleucin in monoklonalen Antikörpern mittels Nanoflow-LCMS(n). Anal. Chem. 89, 720–727. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.6b03261 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hollmann, A., Martinez, M., Maturana, P., Semorile, LC & Maffia, PC Antimikrobielle Peptide: Interaktion mit Modell- und biologischen Membranen und Synergismus mit chemischen Antibiotika. Vorderseite. Chem. 6, 204. https://doi.org/10.3389/fchem.2018.00204 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Horn, JN, Romo, TD & Grossfield, A. Simulation des Mechanismus antimikrobieller Lipopeptide mit Allatom-Molekulardynamik. Biochemie 52, 5604–5610. https://doi.org/10.1021/bi400773q (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Armas, F. et al. Design, antimikrobielle Aktivität und Wirkungsmechanismus von arg-reichen ultrakurzen kationischen Lipopeptiden. PLoS ONE 14, e0212447. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0212447 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, J. et al. Membranaktive antimikrobielle Peptide: Umsetzung mechanistischer Erkenntnisse in Design. Vorderseite. Neurosci. 11, 73. https://doi.org/10.3389/fnins.2017.00073 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao, X., Zhen, Z., Wang, X. & Guo, N. Synergie einer Kombination von Nisin und Zitronensäure gegen Staphylococcus aureus und Listeria monocytogenes. Lebensmittelzusatz. Kontam. Teil A 34, 2058–2068. https://doi.org/10.1080/19440049.2017.1366076 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Field, D. et al. In-vitro-Aktivitäten von Nisin und Nisin-Derivaten allein und in Kombination mit Antibiotika gegen Staphylokokken-Biofilme. Vorderseite. Mikrobiol. 7, 508. https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.00508 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Selegard, R. et al. Plantaricine verstärken die Wirkung herkömmlicher Antibiotika gegen Staphylococcus epidermidis deutlich. Zukünftiges Mikrobiol. 14, 195–205. https://doi.org/10.2217/fmb-2018-0285 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hutchings, MI, Truman, AW & Wilkinson, B. Antibiotika: Vergangenheit, Gegenwart und Zukunft. Curr. Meinung. Mikrobiol. 51, 72–80. https://doi.org/10.1016/j.mib.2019.10.008 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Renwick, MJ, Brogan, DM & Mossialos, E. Eine systematische Überprüfung und kritische Bewertung von Anreizstrategien für die Entdeckung und Entwicklung neuartiger Antibiotika. J. Antibiot. 69, 73–88. https://doi.org/10.1038/ja.2015.98 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Joo, HS, Fu, CI & Otto, M. Bakterielle Resistenzstrategien gegen antimikrobielle Peptide. Philos. Trans. R. Soc. London. B 371, 20150292. https://doi.org/10.1098/rstb.2015.0292 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Vaara, M. Neue Ansätze bei Peptidantibiotika. Curr. Meinung. Pharmacol 9, 571–576. https://doi.org/10.1016/j.coph.2009.08.002 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Luong, HX, Thanh, TT & Tran, TH Antimikrobielle Peptide: Fortschritte bei der Entwicklung therapeutischer Anwendungen. Lebenswissenschaft. 260, 118407. https://doi.org/10.1016/j.lfs.2020.118407 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Maldonado, A., Ruiz-Barba, JL & Jimenez-Diaz, R. Reinigung und genetische Charakterisierung von Plantaricin NC8, einem neuartigen durch Kokultur induzierbaren Zwei-Peptid-Bacteriocin aus Lactobacillus plantarum NC8. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 69, 383–389 (2003).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Diese Arbeit wurde von der Swedish Foundation for Strategic Research (SSF), RMX18 0039, und der Knowledge Foundation, 20180148, unterstützt.

Open-Access-Finanzierung durch die Universität Örebro.

Fakultät für Medizinische Wissenschaften, Fakultät für Medizin und Gesundheit, Abteilung für Mikrobiologie, Immunologie und Reproduktionswissenschaft, Universität Örebro, Örebro, Schweden

Emanuel Wiman, Torbjörn Bengtsson und Hazem Khalaf

Labor für molekulare Materialien, Abteilung für Biophysik und Bioingenieurwesen, Abteilung für Physik, Chemie und Biologie, Universität Linköping, 581 83, Linköping, Schweden

Elisa Zattarin, Daniel Aili & Robert Selegård

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HK und TB trugen zur Konzeption und Gestaltung der Studie bei; EW, EZ, RS und HK trugen zur Datenerfassung und -analyse bei; EW, EZ, RS, DA, TB und HK interpretierten die Daten; EW und EZ verfassten den ersten Entwurf des Manuskripts; RS und HK haben Teile des Manuskripts geschrieben; HK, TB, RS und DA überprüften den Originalentwurf des Manuskripts. Alle Autoren haben zur Überarbeitung des Manuskripts beigetragen, die eingereichte Version gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Robert Selegård oder Hazem Khalaf.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wiman, E., Zattarin, E., Aili, D. et al. Entwicklung neuartiger antimikrobieller Breitband-Lipopeptide, abgeleitet von Plantaricin NC8 β. Sci Rep 13, 4104 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31185-8

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Eingegangen: 22. November 2022

Angenommen: 07. März 2023

Veröffentlicht: 13. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31185-8

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